重症筋無力症患者における胸腺腫内抗原特異的B細胞の探索

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K07434
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 高田 和城 大阪大学, 医学系研究科, 招へい教員 (20573223)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 木下 允 大阪大学, 医学系研究科, 特任講師(常勤) (10573222)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 重症筋無力症 / B細胞

Outline of Annual Research Achievements

重症筋無力症は病原性のある神経筋接合部に対する自己抗体により四肢の易疲労感や筋脱力を来す自己免疫疾患である。疾患診断のための血中の抗体検出は古くからおこなわれているが、血中に存在する自己反応性Ｂ細胞が非常に稀であるためこれまで分離・検出は非常に困難であり、自己免疫性抗体産生細胞についてはほとんど明らかとなっておらず、その分化・成熟課程については不明である。
これまでの報告より病原性自己抗体産生B細胞は胸腺腫合併抗アセチルコリン受容体抗体陽性重症筋無力症患者では胸腺腫中で分化・成熟することが示唆されている。
本研究の目的は病原性を有する自己抗体産生B細胞の分離を行い、その機能・分化成熟機転の解析を行うことである。そのためにまず、重症筋無力症患者由来Ｂ細胞に特異的に発現している分子の有無を調べるために、2年前より行っているスタートアップ研究より本研究に着手している、抗アセチルコリン受容体抗体陽性患者の胸腺腫合併症例において、胸腺腫摘出標本からのFACSを用いたsingle cell sortingおよびRNAシークエンスを行い、その発現プロファイルの解析を行い、ターゲットとして主に重症筋無力症患者由来B細胞で特異的に発現している表面マーカーの探索を行う。これまでに手術サンプルの処理、抗体染色、ＦＡＣＳ、single cell sorting、ＲＮＡライブラリー作成といった一連の実験手法の確立を行うことができ、パイロットスタディー4例を行い、採取したB細胞の解析ではgerminal centerを構成する細胞の増加を認め、naive B cellからmemory B cell, plasmablastまでのB細胞を認め、B細胞自体の分化・成熟は比較的行われていると考えられた。
現在、重症筋無力症患者由来B細胞に特異的に発現している主に表面マーカーの検索のため解析を行っている。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

ＲＮＡシークエンスデータの解析の遅れおよび手術サンプル数の減少

Strategy for Future Research Activity

RNAシークエンスデータにおいて重症筋無力症B細胞に特異的に発現している表面マーカーがあればそれをターゲットとしたsingle cell sortingを行う。次いでその分離細胞が実際にアセチルコリン受容体反応性の抗体を産生しているかについて確認するために、それぞれの細胞のB細胞受容体の長鎖および短鎖の可変領域のクローニングを行い、トランスフェクションすることにより実際に抗体を産生させ、それらの抗体とアセチルコリン受容体抗体との反応性をcell based assayで確認を行う。
上記方法で抗アセチルコリン受容体抗体産生B細胞を得ることができなかった場合。
アセチルコリン受容体は5つのサブユニットから構成されていることが知られているが、その内αサブユニットとの反応性が高いことが知られている。そのため抗アセチルコリン受容体のαサブユニットの蛍光標識蛋白を作成し、それをターゲットとしたsingle cell sortingを行い上記同様の手順で分離したＢ細胞のＢ細胞受容体の抗体を産生。実際にアセチルコリン受容体を反応するかについて検討を行う。
上記により抗体産生Ｂ細胞が得られれば可変領域のシークエンスも可能となり、同時に採取した末梢血単核球のＢ細胞受容体の可変領域の解析と合わせ、抗体の分化・成熟の解析などを進めていく

Causes of Carryover

本基金の前年度より2年間の研究スターアップの研究資金があり、また本年度は実験に使用する手術検体の件数が予想外にすくなかったため、前年度までの研究資金使用を優先したため、本基金の使用が少なくなった。