2022 Fiscal Year Research-status Report

重症筋無力症患者における胸腺腫内抗原特異的B細胞の探索

Research Project

Project/Area Number	21K07434
Research Institution	Osaka University
Principal Investigator	高田和城大阪大学, 大学院医学系研究科, 招へい教員 (20573223)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	木下允大阪大学, 大学院医学系研究科, 特任講師(常勤) (10573222)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	重症筋無力症 / B細胞
Outline of Annual Research Achievements	重症筋無力症は病原性のある神経筋接合部に対する自己抗体により四肢の易疲労感や筋脱力を来す自己免疫疾患である。疾患診断のための血中の抗体検出は古くからおこなわれているが、血中に存在する自己反応性B細胞が非常に稀であるためこれまで分離・検出は非常に困難であり、自己免疫性抗体産生細胞についてはほとんど明らかとなっておらず、その分化・成熟課程については不明である。これまでの報告より病原性自己抗体産生B細胞は胸腺腫合併抗アセチルコリン受容体抗体陽性重症筋無力症患者では胸腺腫中で分化・成熟することが示唆されている。本研究の目的は病原性を有する自己抗体産生B細胞の分離を行い、その機能・分化成熟機転の解析を行うことである。そのためにまず、重症筋無力症患者由来B細胞に特異的に発現している分子の有無を調べるために、2年前より行っているスタートアップ研究より本研究に着手している、抗アセチルコリン受容体抗体陽性患者の胸腺腫合併症例において、胸腺腫摘出標本からのFACSを用いたsingle cell sortingおよびRNAシークエンスを行い、その発現プロファイルの解析を行い、ターゲットとして主に重症筋無力症患者由来B細胞で特異的に発現している表面マーカーの探索を行う。これまでに手術サンプルの処理、抗体染色、FACS、single cell sorting、RNAライブラリー作成といった一連の実験手法の確立を行うことができ、パイロットスタディーで、採取したB細胞の解析ではgerminal centerを構成する細胞の増加を認め、naive B cellからmemory B cell, plasmablastまでのB細胞を認め、B細胞自体の分化・成熟は比較的行われていると考えられた。現在、胸腺細胞および末梢血のRNAシークエンスを計画している。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason 手術サンプル数の減少のため得られるサンプル数が予定より少ない。細胞のみならず、組織からのRNAの新たな解析方法の出現のため解析法の再検討を行っている。
Strategy for Future Research Activity	組織切片からRNAシークエンスが可能となるVisiumが今回のサンプルで可能かどうかの検討を行っている。基本的にはRNAシークエンスデータにおいて重症筋無力症B細胞に特異的に発現している表面マーカーがあればそれをターゲットとしsingle cell sortingを行う。次いでその分離細胞が実際にアセチルコリン受容体反応性の抗体を産生しているかについて確認するために、それぞれの細胞のB細胞受容体の長鎖および短鎖の可変領域のクローニングを行い、トランスフェクションすることにより実際に抗体を産生させ、それらの抗体とアセチルコリン受容体抗体との反応性をcell based　assayで確認を行う。上記方法で抗アセチルコリン受容体抗体産生B細胞を得ることができなかった場合。アセチルコリン受容体は5つのサブユニットから構成されていることが知られているが、その内αサブユニットとの反応性が高いことが知られている。そのため抗アセチルコリン受容体のαサブユニットの蛍光標識蛋白を作成し、それをターゲットとしたsingle cell sortingを行い上記同様の手順で分離したB細胞のB細胞受容体の抗体を産生。実際にアセチルコリン受容体を反応するかについて検討を行う。上記により抗体産生B細胞が得られれば可変領域のシークエンスも可能となり、同時に採取した末梢血単核球のB細胞受容体の可変領域の解析と合わせ、抗体の分化・成熟の解析などを進めていく。
Causes of Carryover	本年度は実験に使用する手術検体の件数が予想外にすくなかったため、前年度までの研究資金使用を優先したため、本基金の使用が少なくなった。また細胞のRNAシークエンス解析を行う予定であったが新たな研究手法の出現のため費用面や得られるデータ内容、まとまった数の解析を同時に行う予定などから、そちらを行うかどうかの検討を行っていたため今年度の使用が少なくなった。