新規蛋白質NT5DC2のカテコールアミン合成における機能の解明：精神疾患との関連

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K07530
• Research Institution: Fujita Health University
• Principal Investigator: 中島 昭 藤田医科大学, 医学部, 教授 (20180276)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山口 央輝 四日市看護医療大学, 看護医療学部, 准教授 (70319250)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: NT5DC2 / チロシン水酸化酵素 / パーキンソン病 / カテコールアミン

Outline of Annual Research Achievements

カテコールアミン合成異常とパーキンソン病発症との関連について諸説がある理由は、細胞内のカテコールアミン合成制御機構が十分に解明されていないためである。我々は、機能未知であった細胞内タンパク質NT5DC2が、カテコールアミン合成を抑制することを2019年に発見した。NT5DC2の機能を解明して、カテコールアミン合成経路におけるその役割を明確にするため、下記の実験を進めた。
１）NT5DC2がカテコールアミン合成と細胞内代謝に与える影響：　①siRNAによりPC12D細胞内のNT5DC2をダウンレギュレーション後、細胞破砕液をチロシン水酸化酵素に焦点を当てたウェスタンブロット（リン酸化）およびHPLCによるカテコールアミン解析を行った。②NT5DC2発現ベクターおよびNT5DC2分子にFlag-tagを組み込んだ発現ベクターを作製した。これをPC12D細胞内で過剰発現させた後、細胞破砕液をウェスタンブロット（リン酸化）およびHPLCによるカテコールアミン解析を行った。①と②のダウンレギュレーションと過剰発現の結果は、相互を裏打ちする結果となっている。③LC-MS/MSによるメタボローム解析を行い、代謝物質の挙動を解析して背景にある生化学的機序を解明する予定であり、その準備を進めた。
２）NT5DC2へ結合するタンパク質の網羅的解析：　NT5DC2-Flag-tag発現ベクターをPC12D細胞内で過剰発現させ、磁気ビーズを用いてNT5DC2-Flag-tagを精製した。これをトリプシン分解したペプチド断片として、LC-MS/MSを用いたプロテオーム解析している。現在結論は得られていないが、実験方法を確立しており、NT5DC2に結合しているタンパク質の網羅的な同定を進めている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

１）NT5DC2がカテコールアミン合成と細胞内代謝に与える影響、２）NT5DC2へ結合するタンパク質の網羅的解析、の両者とも概ね順調に進んでいる。一方、１）の②の実験結果は、得られている方向は同じであるがデータのばらつきが大きく、繰り返して実験を行う必要がある。ばらつきの原因を解明することで、新たな発見に繋がる可能性もあるため慎重に実験を進めている。
２）NT5DC2へ結合するタンパク質の網羅的解析、についても概ね順調に実験を進めている。LC-MS/MSを用いたプロテオーム解析については安定的な解析方法を確立した。NT5DC2-Flag-tagの精製度合いが、LC-MS/MSの解析に大きな影響を与えることが分かったため、精製段階に注力して研究を進めている。

Strategy for Future Research Activity

NT5DC2のチロシン水酸化酵素以外のカテコールアミン合成系酵素への相互作用、およびNT5DC2の細胞内局在を明確にするため、次の実験を進める予定である。
１）NT5DC2のカテコールアミン合成系酵素への相互作用：　NT5DC2はチロシン水酸化酵素のリン酸化に関与することが現時点で推定されている。そこで、チロシン水酸化酵素以外のカテコールアミン合成系酵素に対するNT5DC2の働きを、ウェスタンブロット（リン酸化）、カテコールアミン解析、LC-MS/MSによるプロテオーム解析により解明する。
２）細胞内局在部位解析に基づくNT5DC2の機能の解明：　タンパク質の機能を明確にするためには細胞内局在の解析が重要となる。プロテオーム解析を用いて得られたNT5DC2と相互作用するタンパク質の情報に、細胞内局在の情報を加味して、NT5DC2の機能を推定する。細胞内局在は抗体を用いた免疫染色だけでなく、NT5DC2を発現するGFP融合ベクターの作製も想定している。

Causes of Carryover

試薬・消耗品等については計画に基づいて購入したが、大学調達課の努力により納入価格が当初予定よりも低くなったため、若干の未使用額が生じた。次年度（2022度）に繰り越された未使用額については、より高感度・高性能な試薬の購入に充てる予定である。