2023 Fiscal Year Research-status Report
Development of Minimally Invasive MR Imaging Method for biological materials Using Carbon-13 Labeled Antibodies
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21K07568
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
笹尾 明 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 特任講師 (30508487)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
寺沢 宏明 熊本大学, 大学院生命科学研究部(薬), 教授 (10300956)
笹尾 亜子 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 助教 (80284751)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 炭素13 / 抗体 / 13C-MRI |
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| Outline of Annual Research Achievements |
抗体への13C導入として、13C標識アミノ酸を抗体産生細胞であるハイブリドーマ細胞の培養液に添加する方法を行ったが、導入困難であったため、既存の抗体やタンパク質、薬剤などに後から13Cを高効率に導入する方法を試行した。まずは、入手しやすいウシ血清アルブミンにEDC/Water soluble carbodiimide + Sulfo NHSを使用してメチル13Cメチオニンのカルボキシル基をタンパク質側のリジンのεアミノ基と架橋させることとした。未反応の試薬は過剰量のグリシン溶液でクエンチし、10ｋDaのスピンカラムを用いて限外ろ過により除去した。未反応のメチル13Cメチオニンが十分除去された反応物の13C- NMR測定したところ、積算時間3分程度で標識したメチル13Cの鋭いがみられた。この結果は「第51回日本磁気共鳴医学会大会（軽井沢）」にて発表を行っている。さらに、一度反応させたサンプルに対して前述のメチル13Cメチオニン架橋を多段階で行うと架橋効率が上昇し、信号強度が上昇する現象がみられたが、タンパク質への過度の架橋は立体構造の変化を起こし、抗体やタンパク質の本来の機能を損なう可能性があるため、反応回数には制限があると考えられた。そこで、中心にジスルフィド結合を有し、還元後にアミノ基-スルフヒドリル基間架橋剤にてタンパク質に結合可能なCystamine core dendrimerを使用することを考えた。市販されているPAMAM dendrimer, cystamine core, generation 2.0 solutionは樹状部末端に計16個のアミノ基を有しており、この部分にメチル13Cメチオニンのカルボキシル基を架橋した。反応物を3kDaのフィルターで精製して、13C-NMRにて信号確認したところ約30秒で良好な信号を得ることができるようになってきている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
タンパク質や抗体に13Cを導入する技術に関して直接タンパク質構造内に組み込むことは困難であったが、アミノ基とカルボキシル基の穏やかな条件での架橋反応が汎用的に使用可能となったため、研究の進捗が速くなった。現在、13C-NMRの信号をさらに上昇させる反応方法を開発中であり、順調に進展しているものと思われる。
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| Strategy for Future Research Activity |
デンドリマーへの13Cメチオニン架橋反応は安定して行うことができるが、反応にあずからないメチオニンのアミノ基は遊離した状態である。このアミノ基に対してメチオニンが連鎖的に結合しすぎると分子量が増大しすぎてしまい13C-NMR信号のブロード化の恐れがあるため、酢酸やプロピオン酸などのカルボン酸で遊離アミノ基にキャップを行う方向で反応を調整する。また、これらのカルボン酸に13C標識したものを用いて、さらに13C-NMR信号の増強を図る。出来上がった化合物を抗体に架橋し、ELISA等のin vitro実験で画像化確認を行い、組織や生体での画像化を試みる。
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| Causes of Carryover |
タンパク質への有効な13C標識の方法を模索する過程で化学反応の最適化を行っていたが、小規模な反応で確認を行っていたため、試薬や機材にかかる予算を絞ることとなった。しかしながら、現在すでに13C標識反応の適正化はほぼ完了しているため、画像化に必要な量の化合物を十分に得るには反応の規模を大きくする必要があり、今後使用する費用は増大するものと思われる。
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