2022 Fiscal Year Research-status Report
重粒子線照射に特徴的なDNA二本鎖切断の修復機構の解析
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21K07658
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
泉 雅子 国立研究開発法人理化学研究所, 仁科加速器科学研究センター, 専任研究員 (00280719)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 重粒子線 / DNA修復 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度と同様に、ヒトHeLa細胞にX線あるいは重粒子線（線エネルギー付与率：80-300 keV/micrometer)を照射した後にクロマチン結合画分を得て、DNA損傷に応じてクロマチン上にリクルートされてくる修復タンパク質をウエスタンブロットにより解析した。その結果、DNA二本鎖末端の齧り込みを促進するCtIPのリン酸化は、X線に比べて重粒子線の方が促進されていることが判明した。この結果は、Ｘ線に比べて重粒子線の場合は、非相同末端結合以外の三つの修復経路（相同組換え、一本鎖アニーリング、代替的非相同末端結合）が起こりやすくなっていることを示唆している。
また、相同組換えと一本鎖アニーリングに関与するRad52は、X線に比べて重粒子線の方がクロマチンへの結合量が多かった。さらに、Rad52の一部は、線量に依存して10kDa程度分子量が増加する翻訳後修飾が起きており、その修飾もＸ線に比べて重粒子線の方が顕著であった。昨年度明らかにしたRad51の動態に関する解析結果とも合わせると、重粒子線の場合は5Gy程度までは相同組換えが機能するが、その後は相同組換えに代わり一本鎖アニーリングが起きやすくなっていると考えられる。一方、代替的非相同末端結合に関与するDNAポリメラーゼシータは、放射線照射に依存したクロマチン結合を生化学的分画法や蛍光抗体法による局在変化により検出することが困難であり、その動態を明らかにすることができなかった。
Rad52の翻訳後修飾に関してX線照射による解析を行い、X線照射後まもなく修飾が起きていること、修飾は細胞周期に依存しておりG1期よりもG2期に顕著であること、また複製阻害剤処理によっても同様の修飾が起きることを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度は昨年度に引き続き、DNA損傷にリクルートされる修復タンパク質をクロマチン上に保持したまま分画する系を用いて解析を行った。その結果、DNA二本鎖切断末端の齧り込みを促進するCtIPの活性化、相同組換えと一本鎖アニーリングの双方に関与するRad52の局在変化について新たな知見が得られた。また、Rad52の翻訳後修飾についても興味深い知見が得られた。一方、代替的非相同末端結合に関与するDNAポリメラーゼシータについては、従来の生化学的分画法や蛍光抗体法では検出が困難であった。そこで今後は、細胞を架橋剤で処理して修復タンパク質をDNA上に結合させた後にDNAを断片化し、リン酸化型ヒストンH2AX等を指標に免疫沈降を行って共沈するか調べる等、別の方法で関与を検討する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
重粒子線照射後のDNA二本鎖切断修復における一本鎖アニーリングの関与についてさらに解析するために、Rad52をsiRNAによりノックダウンしたりRad52の阻害剤を用いたときに、DNA修復効率がどのように変化するかをヒストンH2AXのリン酸化を指標に調べる。また、放射線感受性に与える影響をコロニー形成法により評価する。Rad52の翻訳後修飾の実態を明らかにするため、Rad52を大量に精製して質量分析により共有結合しているタンパク質を同定するとともに、共有結合しているアミノ酸を同定する。ゲノム編集によりそのアミノ酸を別のアミノ酸で置換した時に、相同組換えや一本鎖アニーリングの効率が変化するか調べたり、変異を導入したRad52の動態が野生型とどのように異なるのか、生化学的分画法や蛍光抗体法により解析し、修飾の生理的意義を検証する。
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| Causes of Carryover |
令和３年度は新型コロナウイルスの影響で年度途中まで加速器実験が予定通り実施できなかったため、当初の計画通り研究費を使い切れなかった。その余剰分により次年度使用額が生じている。
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