1細胞解析を用いた放射線治療による腫瘍微小環境、免疫応答変化の解析

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K07661
• Research Institution: National Cancer Center Japan
• Principal Investigator: 北條 秀博 国立研究開発法人国立がん研究センター, 東病院, 医員 (60638774)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 影山 俊一郎 国立研究開発法人国立がん研究センター, 東病院, 医員 (60644979)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 1細胞解析 / 食道癌 / 放射線治療 / PD-L1 / マクロファージ

Outline of Annual Research Achievements

患者同意が得られた計5例の放射線治療対象の食道扁平上皮癌患者から採取した治療前（3例）、治療中～治療後7日以内（4例）、治療後1か月後（2例）の組織検体を用いたSingle cell RNA sequencingを施行した。上部消化管内視鏡にて採取された生検検体をMACS;Tissue Dissociation Kits (Miltenyi Biotec)を用いて細胞分離を行い、Single Cell 5' v1 Dual Index Gene Expression Libraries kit (10X Genomics)を用いてライブラリを作成し、Novaseq6000によるsequenceを行った。得られたFASTQファイルからR v4, Seurat v4、SingleRを用いてCell annotation, Gene expression analysis, Clustering analysis, 遺伝子発現解析を行った。その結果、放射線治療前、治療後いずれからも10000を超える細胞の単離、遺伝子発現解析が可能であった。細胞レベルでは放射線照射後にリンパ球の減少、マクロファージの増加が確認され、遺伝子発現レベルでも放射線によるIFN応答の増強や、VEGF pathwayの活性化などが確認された。
2022年度の成果として、前年度で解析した細胞群のうち、Macrophage、Monocyte、Dendritic cellの一部に、放射線治療後、PD-L1を強く発現する細胞群を見出している。さらにこの細胞群は、SIRPA, IDO1等の免疫抑制遺伝子を同時に強く発現する細胞であることも確認している。このような細胞群は、放射線治療と併用する免疫治療の標的となりえる可能性が高く、今後癌組織内での局在や、機能について解析を進める予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

患者同意が得られた計5例の放射線治療対象の食道扁平上皮癌患者から採取した治療前（3例）、治療中～治療後7日以内（4例）、治療後1か月後（2例）の組織検体を用いたSingle cell RNA sequencingを施行している。
また、シークエンスデータ取得後の解析も予定通り施行されており、解析に十分量の細胞を得ているため今後の解析も予定通り施行可能である。

Strategy for Future Research Activity

2022年度では検体集積を完了し、シークエンス後の解析を進めている。
現在放射線治療後の微小環境変化として、リンパ球の減少、マクロファージの増加、マクロファージ内のPD-L1, SIRPA, IDO1の活性化について最も着目している。これらの遺伝子群はすでに免疫チェックポイント阻害薬が開発されており、放射線治療併用免疫治療の標的として、出口戦略の確立が可能な遺伝子である。一方でこのような放射線治療後のPD-L1陽性細胞の機能不明な部分が多く、今後は組織内局在や、隣接する癌細胞の解析などにより、これらの細胞の機能を考察し、治療開発につなげていく方針である。

Causes of Carryover

2023年度では引き続き研究への登録と腫瘍組織採取と解析を継続する。
このため、試薬やガラス器具、プラスチック器具が更に必要となることが予想される。また、さらなる解析を行う事も考えておりその費用も必要となる。更に、
国内、国際学会参加費、論文投稿に際し、校正費等にも使用する予定である。