2022 Fiscal Year Research-status Report
標的ゲノム編集/系統的ノックダウンによる染色体転座頻度を増加させる因子の探索
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21K07681
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| Research Institution | Fukushima Medical University |
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Principal Investigator |
津山 尚宏 福島県立医科大学, 医学部, 准教授 (10335747)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
阿部 悠 長崎大学, 原爆後障害医療研究所, 助教 (00722472)
工藤 健一 福島県立医科大学, 医学部, 助教 (00805799) [Withdrawn]
坂井 晃 福島県立医科大学, 医学部, 教授 (70284221)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 染色体転座 / 電離放射線 / CRISPR-Cas9 / 放射線感受性 / 責任遺伝子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
電離放射線はDNA二本鎖切断を介して細胞ゲノムに転座などのランダムな染色体異常を誘発し、異常頻度は線量依存的に増加する。DNA二本鎖切断修復の過程で、異なる切断末端同士が再結合して染色体異常（転座）が生じる分子機構の全体像は不明である。また特定の染色体転座は疾病の原因となるため、染色体転座を調節する機構の解明は重要である。
本研究ではまず、正常ヒト集団の自然に生じる染色体転座頻度と放射線によって誘導される染色体転座頻度の基礎データを得るため、インフォームドコンセントを得た若い健常人の末梢血リンパ球を単離し、自然に生じた染色体転座頻度および放射線照射により誘発された転座頻度を解析している。
同時に培養細胞を用いて染色体転座の分子機構解析を行っている。CRISPR-Cas9を用いたt(11;14)転座誘導系に加えt(11;22), t(5;6)転座誘導系を作成し、導入した培養細胞の転座頻度をリアルタイムPCRでモニターする。導入する細胞には、予め、DNA二本鎖切断(DSB)修復シグナル・ゲノム不安定性、放射線感受性を修飾する責任遺伝子、代謝やレドックス制御シグナル分子群について、特異的阻害剤処理やレトロウイルスshRNA発現ベクターによる系統的なノックダウンを行い、転座頻度の変化を観察する。さらにゲノム編集を用いて作製したATMなどの既知遺伝子異常のヘテロ接合細胞を用いた転座誘導影響解析を行う。加えて、未知の機序解明のため全ゲノムCRISPR-Cas9ノックアウトライブラリー導入による易転座誘発性の獲得と標的同定を行い、染色体転座誘発機序の理解を目指す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
健常若年者集団における自然/放射線誘発線染色体転座頻度の解析については、全ての検体について非照射・0.2,1Gy照射検体のFISH標本を作製してMetaferシステムによる5000メタフェーズ以上の画像取り込みを完了し、染色体異常頻度解析を逐次進めている。
CRISPR-Cas9によるt(11;22), t(5;6)転座誘導系は培養細胞に導入して染色体転座が誘導されることを確認し、shRNA発現ウイルスベクターを導入した細胞に対し転座誘導ベクターを導入して、転座頻度解析を行っている。
所属講座の他の研究に時間を要したため、本研究が遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究計画書の内容に従い、順次解析を進める。
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| Causes of Carryover |
校務および講座の他の研究に時間を費やしたため本研究に裂く時間がとれず、次年度使用額が生じた。
今年度は研究計画に従い、助成金を計画的に使用する予定である。
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