2022 Fiscal Year Research-status Report
新規リアルタイムDNA損傷修復応答検出システムの構築と腫瘍内DNA損傷応答の解析
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21K07727
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
小林 稔 京都大学, 生命科学研究科, 特定助教 (40644894)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
原田 浩 京都大学, 生命科学研究科, 教授 (80362531)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | DNA損傷修復 / In vivo imaging |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度までに作成したDNA損傷を誘発する薬剤処理によってルシフェラーゼ活性が上昇する分割ルシフェラーゼ融合遺伝子を恒常的に発現する細胞を用いて、DNA損傷を誘発する薬剤に加えて放射線照射によるDNA損傷誘導時のルシフェラーゼ活性の変化を検討した。しかしながら、放射線照射時に、常温の照射装置内に一時的に細胞を置いた際の温度変化によって放射線照射の有無に関わらずルシフェラーゼの活性が大きく変動してしまったため、in vitroでの放射線依存的DNA損傷によるルシフェラーゼ活性変化を検出することが困難であった。そこで、放射線照射によるDNA損傷を確認するために温度恒常性が期待できるin vivoの移植腫瘍を用いた系で評価を行った。
分割ルシフェラーゼ融合遺伝子を恒常的に発現する細胞をヌードマウスに移植し、腫瘍を作成した。作成した担がんマウスに対して放射線照射を行い、マウスに対して放射線照射後、様々なタイムポイントでルシフェリンを投与することで、腫瘍組織における放射線照射後の発光強度の変化を計測した。その結果、放射線照射後に一過的にルシフェラーゼの発光強度が増加し、その後減少するという、過去の知見と一致する結果が得られた。さらに、長期的な観察でも発光強度の変動が観察された。これらの結果から、作成した分割ルシフェラーゼ融合遺伝子がDNA損傷修復応答をin vivoでも観察できることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
前年度に構築した分割ルシフェラーゼを用いたDNA日本差切断やDNA日本差切断修復系を検出するレポーター遺伝子を恒常的に発現する細胞を用いて移植腫瘍を作成した。さらに該当腫瘍に放射線照射を行うことでルシフェラーゼ活性のカイネティクスの測定を行い、発光強度の増減が観察された。
当初の計画通り、移植腫瘍を用いたルシフェラーゼ活性の変化の観察を行い、おおむね計画通りに実験が進行している。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度の移植腫瘍を用いて得られた放射線照射によるルシフェラーゼ活性の変化カイネティクスをもとに、DNA修復阻害剤などの投与によって、DNA損傷や修復活性がどのように変化するか、さらにその変化が腫瘍の退縮に効果があるかどうかを検討する。
一方で、in vitroの実験で温度変化という想定していなかった外的要因で分割ルシフェラーゼの活性変化が起こったことから、アッセイ系が正しく機能しているかどうかの検証を並行して進めていく。
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| Causes of Carryover |
コロナ禍のため、学会参加の回数が減ったことと、実験が順調に進んだこと、想定外の問題のため一部の実験が無くなったことで使用金額が予定金額よりも小さくなった。
今後、in vivoのマウスを用いてより詳細な実験を行っていく
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