2023 Fiscal Year Annual Research Report
新規リアルタイムDNA損傷修復応答検出システムの構築と腫瘍内DNA損傷応答の解析
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21K07727
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
小林 稔 京都大学, 生命科学研究科, 特定助教 (40644894)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
原田 浩 京都大学, 生命科学研究科, 教授 (80362531)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | DNA損傷修復 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ここまでのin vitro実験では、DNA損傷修復関連タンパクと融合した分割ルシフェラーゼに対して、分割していないfirefly luciferaseをnegative controlとして用いていた。しかし、DNA損傷修復関連タンパクと融合していない分割ルシフェラーゼを用いたとき、DNA損傷修復関連タンパクと融合した際と似たDNA損傷誘導試薬投与依存的なluciferase発光の上昇が観察された。この結果は分割ルシフェラーゼがDNA損傷誘導試薬依存的にDNA損傷とは関係なく非特異的に複合体を形成してしまっていることを示唆している。この結果を踏まえ、分割ルシフェラーゼをfirefly luciferase由来のものから薬剤などによるバックグラウンドの変化が低いと言われているNanoLuc由来の分割ルシフェラーゼ発光系であるNanoBitに変更した。
DNA損傷修復関連タンパクとNanoBitを融合したものを作成し、当該分割ルシフェラーゼレポーターシステムでDNA損傷誘導試薬依存的な発光強度の上昇が観察された。またこのときDNA損傷修復関連タンパクと融合していないNanoBit単独のものはDNA損傷誘導試薬依存的な発光強度の上昇は観察されなかったことから、今回の発光強度の上昇が、DNA損傷部位への損傷修復タンパクの集積によるものであることが示唆された。
今後はNanoBitとDNA損傷修復関連タンパクを融合したレポーター遺伝子を利用して系の再構築を進める予定ある。
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