Establishment and operation of a method for evaluating enzyme activity in VLCAD and MCAD

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K07753
• Research Institution: Shimane University
• Principal Investigator: 小林 弘典 島根大学, 学術研究院医学・看護学系, 講師 (70397868)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: VLCAD / 極長鎖アシルCoA脱水素酵素 / 新生児マススクリーニング / 残存酵素活性測定

Outline of Annual Research Achievements

本年度は前年度に引き続き，LC-MS/MSを用いた酵素活性測定系の確立，および遺伝子導入の母体となる(VLCAD-/MCAD-)HEK293細胞の作成を行った．LC-MS/MS分析についてはHEK293細胞を用い，VCLAD活性測定の系を確定した．具体的にはC16-CoAを基質として加えたのちのC16:1-CoAを測定した．分析にはLCMS-8030plusを用い，移動相はアセトニトリル＋炭酸アンモニウム10ｍMを用い，カラムはメタルフリーカラムL-colummn2 C8 (3μM,12nm,CERI) を用いて分析を行った．時系列で生成されるC16:1-CoAを定量し，本アッセイにおける反応時間は2.5分が最適であることを確認し，7.5分で基質生成はプラトーに達した．また，HEK293細胞については今年度はCRISPR-Cas9システムを用いてVLCADをノックアウトした細胞を作成し，VLCAD蛋白が発現していない事を確認した．ここにトランスフェクションする変異VLCADを含むベクターを作成した．作成ベクターは，重症型バリアントであるc.533G>A(G185S)，筋型バリアントといわれるc.790A>G(K294E)，c.1144A>C(K382Q)，NBS開始後に発見されている軽症と推定されるc.1820G>C(C607S)，c.1438G>A(M478I)，c.1226C>T(T409M)，c.865G>A(G289R)を作成した．

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

HEK293細胞のノックアウトに時間を要したが，この問題は既に解決済みであり，少なくともVLCAD酵素活性については今後は順調に計画を遂行出来る見込みとなった．

Strategy for Future Research Activity

2023年度は各変異VLCADを導入した細胞における酵素活性測定を行い，実際の酵素活性測定を完了する．MCAD欠損症についても同様のスキームで新規変異の酵素活性測定を行う予定である．

Causes of Carryover

研究計画がわずかに遅延したことにより購入物品等が予定よりも少なくなったため．