2021 Fiscal Year Research-status Report

Development of novel gene therapy for MELAS by editing mitochondorial DNA

Research Project

Project/Area Number	21K07782
Research Institution	Fujita Health University
Principal Investigator	秦龍二藤田医科大学, 医学部, 教授 (90258153)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	尾身実藤田医科大学, 医学部, 助教 (00400416) 八幡直樹藤田医科大学, 医学部, 講師 (60450607) 吉川哲史藤田医科大学, 医学部, 教授 (80288472)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	MELAS / ミトコンドリア病 / ゲノム編集 / TALEN
Outline of Annual Research Achievements	ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様発作症候群(= MELAS) は母系遺伝をするミトコンドリア病の一つで、mtDNAのA3243G, A3252G, G13513A等の点変異が原因で発症することが知られている。１つの細胞内にmtDNAは数百～数千個存在している。MELASの場合、細胞内の変異mtDNAは正常mtDNAと混在し(= heteroplasmy )、変異mtDNAの割合がある一定の閾値を超えると発症すると考えられている（= 閾値効果）。MELASの臨床症状は非常に多様で、乳酸アシドーシス、てんかん、脳卒中様発作といった症状に加えて、糖尿病や心筋症などを併発することが知られている。更に、発症時期や重篤度なども多様であり、その複雑な臨床像を反映する病態メカニズムは推測の域を出ておらず、確立された治療法は存在していない (Essays Biochem 62: 467-481, 2018)。本研究は、MELAS患者由来iPS細胞とMELASモデルマウス(Mito-mice)を用いて、その病態機構の解明と革新的な遺伝子治療法の開発を目的としている。本年度はmitochondria DNAにA2748G変異を持つ mito-miceに対するTALEN pairsの作成を行った。最初にSSA assayにより幾つかのTALEN pairの候補を見いだした。その後このmito-miceの作成に利用された変異mtDNA（A2748G変異）を有するmouse ES cellで同様に検討し更に候補を絞った。その後以下の方法で更に候補を絞り込んだ。 1) N末端側のTALEを1塩基変異させて、その特異性を上げた。 2) 発現ベクターのコドンを改変した。これにより最終的にheteroplasmyが80％あったmouse ES cellにTALEN pairをtranfectしてやると。30％まで軽減させることができ、大変効率の良いTALEN pairの作成に成功した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本年度はmitochondria DNAにA2748G変異を持つ mito-miceに対するTALEN pairsの作成を試み、効率の良いTALEN pairの作成に成功した。従っておおむね順調に進展していると考えられた。
Strategy for Future Research Activity	今後はmitochondria DNAにA2748G変異を持つ mito-miceでの治療効果を検討するため、AAVベクターの開発に重点をおいて研究を進める予定である。
Causes of Carryover	TALEN-pairsのデザインとその効率を検討するため、研究としては足踏み状態になっていた。今後AAV-ベクターの作成等で資金が必要になってくる予定である。