Development of novel gene therapy for MELAS by editing mitochondorial DNA

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K07782
• Research Institution: Fujita Health University
• Principal Investigator: 秦 龍二 藤田医科大学, 医学部, 教授 (90258153)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 尾身 実 藤田医科大学, 医学部, 助教 (00400416) ; 八幡 直樹 藤田医科大学, 医学部, 講師 (60450607) ; 吉川 哲史 藤田医科大学, 医学部, 教授 (80288472)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: MELAS / ミトコンドリア病 / ゲノム編集 / TALEN

Outline of Annual Research Achievements

ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様発作症候群(= MELAS) は母系遺伝をするミトコンドリア病の一つで、mtDNAのA3243G, A3252G, G13513A等の点変異が原因で発症することが知られている。MELASの発症時期や重篤度なども多様であり、その複雑な臨床像を反映する病態メカニズムは推測の域を出ておらず、確立された治療法は存在していない。本研究は、MELAS患者由来iPS細胞とMELASモデルマウス(Mito-mice)を用いて、その病態機構の解明と革新的な遺伝子治療法の開発を目的としている。

前年度はmitochondria DNAにA2748G変異を持つ mito-mice（mit-A2748G-mice）に対するTALEN pairsの作成を行った。最初にSSA assayにより幾つかのTALEN pairの候補を見いだした。その後このmito-miceの作成に利用された変異mtDNA（A2748G変異）を有するmouse ES cellで同様に検討し更に候補を絞った。1)N末端側のTALEを1塩基変異させて、その特異性を上げる。2)発現ベクターのコドンを改変する。といった工夫を行い、これにより最終的にheteroplasmyが80％あったmouse ES cellにTALEN pairsをtranfectしてやると。30％まで軽減させることができ、大変効率の良いTALEN pairの作成に成功した。

本年度はこの効率の良いTALEN pairsを発現するAAVベクター（mit-TALEN-AAV）の作成を行い。既に完了した。現在このmit-TALEN-AAVを現在mit-A2748G-miceの大腿四頭筋に筋肉注射し、骨格筋でのheteroplasmyを改善できるかどうかを検討している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度は前年度に作成したミコンドリアDNAにA2748G変異を持つ mito-miceに対する効率の良いTALEN pairsをAAVベクターに組み込み、mitochondria DNAにA2748G変異を持つ mito-mice（mit-A2748G-mice）を用いて、その治療効果の判定を行っている。従って本研究は概ね順調に進展していると考えられた。

Strategy for Future Research Activity

DNAにA2748G変異を持つ mito-miceに対して、AAVベクターを用いた治療効果を検討し、更に人のミコンドリアDNAにA3243G変異を持つiPS細胞とその細胞から分化誘導した神経細胞に対する有効なTALEN-pairsの開発を進める予定である。

Causes of Carryover

mitochondria DNAにA2748G変異を持つ mito-mice（mit-A2748G-mice）の飼育に手間取り、in vivo実験の開始が遅れたため次年度使用額が生じた。現在動物実験は進行しており、本年度で使い切る予定である。