2022 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of the molecular mechanism and pathophysiology of Niemann-Pick disease type C by a multifaceted approach
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21K07814
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
前川 正充 東北大学, 大学病院, 准教授 (70572882)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
眞野 成康 東北大学, 大学病院, 教授 (50323035)
佐藤 紀宏 東北大学, 大学病院, 助教 (50770723)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | ニーマンピック病C型 / メタボロミクス / プロテオミクス / マルチオミクス / 脂質生理 / 疾患代謝 / 創薬標的探索 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ニーマンピック病C型 (NPC) は、コレステロール輸送タンパク質の機能的欠損を伴う遺伝性疾患であるが、その病態分子機構・病態生理には未だ不明な部分が多い。当研究室ではこれまで、NPC患者血液中で増加するN-palmitoyl-O-phosphocholine-serineなどのバイオマーカーを同定してきたものの、細胞内代謝物の変動の全容は明らかでない。そこで本研究では、NPC病態モデル細胞中を用いたマルチオミクス解析を行った。
プロテオミクスにおいては、野生型細胞と、NPC原因遺伝子であるNPC1の一部をノックアウトした2種類のNPCモデル化細胞を用いた。3種の細胞を培養し、洗浄、回収した。タンパク質を抽出し、トリプシン消化した。ペプチドを希釈し、分析した。質量分析計Orbitrap Fusionに液体クロマトグラフEASY-nLC 1000を接続した装置を用い、m/z 375-1600の範囲でData dependent analysisモードで分析した。解析した結果、総計4000を超えるタンパク質の同定に成功した。発現割合が有意に2倍以上に増減したタンパク質がそれぞれ50種前後確認できた。
メタボロミクスにおいては、洗浄後回収した細胞を冷メタノール中で超音波処理し、遠心上清を乾燥した後、メタノールで再溶解し、分析した。C18分析カラムを用い、飛行時間型質量分析計に超高速液体クロマトグラフを接続した装置を用いた。試料を注入後、グラジエントモードで、低分子領域をスキャン分析した。測定データを補正後、統計解析した。NPCモデル細胞における発現割合が、統計的に有意に2倍以上増加または0.5倍以下に減少したピークを、それぞれ70種程度確認できた。
現在、創薬標的となる代謝経路探索を試みている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ニーマンピック病C型 (NPC) は、コレステロール輸送タンパク質の機能的欠損を伴う遺伝性疾患であるが、その病態分子機構・病態生理には未だ不明な部分が多い。当研究室ではこれまで、NPC患者血液中で増加するN-palmitoyl-O-phosphocholine-serineなどのバイオマーカーを同定してきたものの、細胞内代謝物の変動の全容は明らかでない。そこで本研究では、NPC病態モデル細胞中を用いたマルチオミクス解析を行った。
プロテオミクスにおいては、野生型細胞と、NPC原因遺伝子であるNPC1の一部をノックアウトした2種類のNPCモデル化細胞を用いた。3種の細胞を培養し、洗浄、回収した。タンパク質を抽出し、トリプシン消化した。ペプチドを希釈し、分析した。質量分析計Orbitrap Fusionに液体クロマトグラフEASY-nLC 1000を接続した装置を用い、m/z 375-1600の範囲でData dependent analysisモードで分析した。解析した結果、総計4000を超えるタンパク質の同定に成功した。発現割合が有意に2倍以上に増減したタンパク質がそれぞれ50種前後確認できた。
メタボロミクスにおいては、洗浄後回収した細胞を冷メタノール中で超音波処理し、遠心上清を乾燥した後、メタノールで再溶解し、分析した。C18分析カラムを用い、飛行時間型質量分析計に超高速液体クロマトグラフを接続した装置を用いた。試料を注入後、グラジエントモードで、低分子領域をスキャン分析した。測定データを補正後、統計解析した。NPCモデル細胞における発現割合が、統計的に有意に2倍以上増加または0.5倍以下に減少したピークを、それぞれ70種程度確認できた。
現在、創薬標的となる代謝経路探索を試みている。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在、創薬標的となる代謝経路探索と脂質の生理作用解析を試みている。
脂質類を、各種野生型細胞へ添加し、その影響を調べる。Cell Counting Kit-8を用いた生／死細胞数計測により、細胞毒性と濃度依存性を調べる。
また、マルチオミクス解析により、見出した分子機構ならびに見出した作用を、新規創薬標的と仮定し、本学の創薬等支援技術基盤プラットフォームの化合物ライブラリーを用いて阻害スクリーニングを行う。NPCモデル細胞も用い、その影響を解析し、創薬シーズ探索を探索する。
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