Neuron-specific persistent cytomegalovirus infection in the developing cerebrum

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K07816
• Research Institution: Hamamatsu University School of Medicine
• Principal Investigator: 小杉 伊三夫 浜松医科大学, 医学部, 准教授 (10252173)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: サイトメガロウイルス / 脳発達障害 / 周産期 / 神経細胞特異的エンハンサー / e1-プロモーター

Outline of Annual Research Achievements

MCMV-e1-proにおいて転写開始点からnt -172までがMCMV-IE3結合によるe1-pro活性化に必須とされている．しかし，nt -1000までにIE3結合モチーフが35個存在していることから，これらの結合モチーフがIE3結合によるe1-pro活性化にどの程度関与するかについて検討を行った．転写開始点から，nt -943, nt -839, nt -556, nt -449, nt -193までのe1-pro領域を欠損したe1-proレポータープラスミド，p-e1proΔ943-EGFP, p-e1proΔ839-EGFP, p-e1proΔ556-EGFP, p-e1proΔ449-EGFP, p-e1proΔ193-EGFPを作成した．これらのプラスミドをpcDNA-MCMV-ie3と共にHEK293T細胞に導入し，EGFP発現を比較した．その結果，p-e1proΔ943-EGFP, p-e1proΔ839-EGFP導入細胞では，EGFP発現は極僅かであった．しかし，p-e1proΔ556-EGFP導入細胞で急激な発現増を認め，p-e1proΔ449-EGFP, p-e1proΔ193-EGFPでは暫時発現が増強していった．従って，nt -839までの上流域に存在するIE3結合モチーフもe1-pro活性化に関与し得ることが明らかとなった．このことからnt -449からnt -1373に存在する神経細胞特異的エンハンサーの作用にIE3の結合が関わると推測された．

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

MCMV-e1プロモーター領域に変異を導入した遺伝子組替えMCMVの作成に時間を要している．

Strategy for Future Research Activity

1.MCMV e1-enhancerにおける神経細胞特異的なe1-pro活性化に関わる領域の特定
1e1-enhancer領域(925nt: 161605-162529: gene accession number U68299)を長さ400~500ntの左右2区域に分割し、PCR法によって増幅する。 各々のDNA配列を、e1-pro-448を含む基本トランスファープラスミド(pMCMV-e1-pro448)のプロモーター直上に組込んで、組換え用トランスファープラスミド(pMCMV-e1-enhancer-Lt or -Rt/pro448)を作製する。
2上記pMCMV-e1-enhancer-Lt or -Rt/pro448から相同組換え用DNA配列を切 り出しMCMV野生株(Smith株)が感染したマウスNIH3T3細胞に導入し、相同組換え法によって2種類の組換えMCMV(rMCMV)を作製する。
3上記rMCMVを初代培養マウス大脳神経細胞及びマウス新生仔大脳に感染させ、rMCMV1373・rMCMV448感染細胞と比較し前者と同様にEGFPを発現するe1-short enhancer領域を確定する。
4確定されたe1-short enhancer領域を2分割し、上記1)-3)と同様の方法で神経細胞特異的に活性化する領域を 絞り込む。5CRSPR-CAS9による遺伝子編集技術を用いて上記で同定された神経細胞特異的に活性化する領域を欠失したrMCMVを作製する。初代 培養神経細胞及び新生仔大脳における同ウイルスの感染性について検討する。

Causes of Carryover

遺伝子組替えMCMVの設計に時間を要したことから，実際に作成するための研究費を年度内に使用できなかった．従って，作成に必要な高額な消耗品費を次年度に繰り越すことにした．

Research Products

• [Journal Article] Prolonged activation of cytomegalovirus early gene e1-promoter exclusively in neurons during infection of the developing cerebrum (2021)
  • Author(s): Kosugi I, Arai Y, Baba S, Kawasaki H, Iwashita T, Tsutsui Y
  • Journal Title: Acta Neuropathol Commun Volume: 9 Pages: 39
  • DOI: 10.1186/s40478-021-01139-0
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Prohibitin-1 Contributes to Cell-to-Cell Transmission of Herpes Simplex Virus 1 via the MAPK/ERK Signaling Pathway (2021)
  • Author(s): Watanabe M, Arii J, Takeshima K, Fukui A, Shimojima M, Kozuka-Hata H, Oyama M, Minamitani T, Yasui T, Kubota Y, Takekawa M, Kosugi I, Maruzuru Y, Koyanagi N, Kato A, Mori Y, Kawaguchi Y
  • Journal Title: J Virol Volume: 95 Pages: e01413-20
  • DOI: 10.1128/JVI.01413-20
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Prevalence of UL97 gene mutations and polymorphisms in cytomegalovirus infection in the colon associated with or without ulcerative colitis (2021)
  • Author(s): Tamura S, Osawa S, Ishida N, Miyazu T, Tani S, Yamade M, Iwaizumi M, Hamaya Y, Kosugi I, Furuta T, Sugimoto K
  • Journal Title: Sci Rep Volume: 11 Pages: 13676
  • DOI: 10.1038/s41598-021-93168-x
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Diagnosis of Ion-Exchange Resin Depositions in Paraffin Sections Using Corrective Light and Electron Microscopy-NanoSuit Method (2021)
  • Author(s): Ooishi M, Yamada S, Itoh T, Meguro S, Yagi H, Kosugi I, Iwashita T, Shinmura K, Misawa K, Hariyama T, Kawasaki H
  • Journal Title: Diagnostics (Basel) Volume: 11 Pages: 1193
  • DOI: 10.3390/diagnostics11071193
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Difference in the distribution of tumor-infiltrating CD8+ T cells and FOXP3+ T cells between micronodular thymoma with lymphoid stroma and micronodular thymic carcinoma with lymphoid stroma (2021)
  • Author(s): Yagi H, Nakaguro M, Ito M, Okumura Y, Takahashi S, Aoshima Y, Enomoto Y, Meguro S, Kawasaki H, Kosugi I, Shimoyama Y, Ogawa H, Tateyama H, Iwashita T
  • Journal Title: Pathol Int Volume: 71 Pages: 453-462
  • DOI: 10.1111/pin.13099
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Differential Diagnosis of Idiopathic Pulmonary Fibrosis Versus Other Interstitial Lung Diseases: A Clinical and Pathophysiological Analysis (2021)
  • Author(s): Aoshima Y, Enomoto Y, Muto S, Meguro S, Kawasaki H, Kosugi I, Fujisawa T, Enomoto N, Inui N, Nakamura Y, Suda T, Iwashita T
  • Journal Title: Lung Volume: 199 Pages: 289-298
  • DOI: 10.1007/s00408-021-00440-y
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Behcet's Disease with Bilateral Renal Infarction Due to Mucormycosis (2021)
  • Author(s): Shimoyama K, Niwa T, Furukawa S, Morishita N, Nagakura Y, Yonezawa H, Hatakeyama M, Okubo Y, Suzuki D, Kosugi I, Shiogama K, Ogawa N
  • Journal Title: Intern Med Volume: 61 Pages: 1077-1083
  • DOI: 10.2169/internalmedicine.7462-21
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Metformin reduces pleural fibroelastosis by inhibition of extracellular matrix production induced by CD90-positive myofibroblasts (2021)
  • Author(s): Aoshima Y, Enomoto Y, Fukada A, Kurita Y, Matsushima S, Meguro S, Kosugi I, Kawasaki H, Katsura H, Fujisawa T, Enomoto N, Nakamura Y, Inui N, Suda T, Iwashita T
  • Journal Title: Am J Transl Res Volume: 13 Pages: 12318-12337
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] 先天性サイトメガロウイルス中枢感染:特集・先天サイトメガロウイルス感染と難聴―診断・予防・治療 ― (2021)
  • Author(s): 小杉伊三夫
  • Journal Title: Monthly Book ENTONI Volume: 261 Pages: 12-17
• [Presentation] 周産期大脳神経細胞に特異的なサイトメガロウイルス持続感染の解析 (2021)
  • Author(s): 小杉伊三夫
  • Organizer: 第68回日本ウイルス学会学術集会
• [Presentation] 周産期大脳神経細胞に特異的なサイトメガロウイルス持続感染の解析 (2021)
  • Author(s): 小杉伊三夫
  • Organizer: 第34回ヘルペスウイルス研究会
• [Presentation] 周産期大脳神経細胞に特異的なサイトメガロウイルス早期遺伝子(e1)プロモーター活性化機構 (2021)
  • Author(s): 小杉伊三夫
  • Organizer: 第110回日本病理学会総会