2022 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of epigenome-mediated mechanisms involved in experimental pulmonary hypertension induced by perinatal insult
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21K07817
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| Research Institution | Mie University |
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Principal Investigator |
三谷 義英 三重大学, 医学部附属病院, 准教授 (60273380)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
丸山 一男 鈴鹿医療科学大学, 医学系研究科, 教授 (20181828)
西村 有平 三重大学, 医学系研究科, 教授 (30303720)
澤田 博文 三重大学, 医学系研究科, 講師 (30362354)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 肺動脈性肺高血圧 / エピゲノム / 周産期刺激 / MCP1 / 炎症 / ゲノム編集 / 動物モデル / 肺動脈平滑筋 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
肺動脈性肺高血圧 (PAH)は、原因不明の予後不良な肺血管閉塞性病変を伴う肺高血圧であり、 新規の治療法と予防法の開発には病態解明が重要である。小児の 肺高血圧の1/3は、出生前・後の周産期侵襲が関与する事、周産期侵襲で生じる新生児肺高血圧の既往が、成人期の肺高血圧の発症に繋がった例が報告され注目されるが、周産期侵襲が思春期・成人期のPAHの発症に関わるかは、今後の課題である。これは、1新生児医療の進歩による成人移行例の増加、2周産期の介入の個別化予防の可能性、3エビゲノム変化の受攻期としての周産期の3点から重要である。最近、周産期低酸素によるPAHラットモデルの肺血管病変の増悪と培 養肺動脈平滑筋細胞の増殖・炎症活性の亢進とそれに関わる機能分子のエピゲノム変化、サイトカイン産生亢進を見出した。 本研究の目的は、1周産期低酸素 暴露PAHラットモデルの機能分子の遺伝子欠損の生体レベルの効果の検討、2機能分子と肺動脈平滑筋細胞の増殖・炎症活性の細胞内経路の解明である。 以上か ら、本研究は、肺循環のBarker仮説の検証研究であり、思春期・成人期のPAHの予防、治療に資する事が、本研究の全体目標である。
研究計画、1ゲノム編集技術を用いたMCP1受容体のCCR2遺伝子欠損の実験的PAHモデルの影響の評価。 2CCL2刺激下の網羅的発現解析を用いて、培養細胞でのCCR2の作用、増殖、炎症活性の細胞内シグナル伝達の解明。３炎症性肺高血圧モデル（モノクロタリン刺激）において、in vivo, invitroの効果を検討する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1.ヒトPAH類似ラットモデルの作成。7週齢雄ラットにSugen 5416 (20mg/kg,1回皮下注)(Sigma)を投与後、1/2気圧(380 mmHg, 10%酸素)21日間の低酸素暴露刺激 を加える。評価病日で心カテ、組織採取を行う。2.周産期低酸素暴露。胎生14日から生後3日まで、妊婦と新生児の14%低酸素暴露を行う。3.CRISPR/Cas9システ ムを用いた遺伝子改変ラットの作成CCR2欠損ラットは、東京大学動物実験施設で研究協力者真下知士博士により作成され、既に三重大学動物実験施設で飼育されている。4.肺高血圧の評価。評価日に小動物用心エコー検査装置を用いて左室変形、肺動脈ドップラーを評価し、内頸静脈からの心臓カテーテル検査により右室圧、大動脈圧を測定する。右室肥大を重量比により評価する。5.組織の分子生物学的、免疫組織学的評価。 評価後、気管切開、小動物用人工呼吸器を用いて人工呼吸下で開胸し、肺凍結サンプル、還流固 定肺を作成する。肺組織の定量的評価、免疫組織学的評価(DAB染色、共焦点レーザー顕微鏡を用いた評価)、分子生物学的評価を行う。6.血管平滑筋培養と増殖活性、炎症活性の判定。肺動脈中枢部、分枝部を実体顕微鏡下 で採取し、内膜、外膜を除去、1mm3の小切片を作成。D- MEM/F12、10%ウシ血清下で培養し(備品のCO2 Incubator)、2-5継代の培養細胞を準備する。 PDGF-BB刺激による増殖性をCCK8アッセイ、TNF-αによる炎症活性をrealtime PCRで評価する。
1.ゲノム編集技術を用いたMCP1受容体のCCR2遺伝子欠損の実験的PAHモデルの影響の評価、CCL2刺激下の網羅的発現解析を用いて、培養細胞でのCCLの作用、増殖、炎症活性の細胞内シグナル伝達の解明。特に、CCL2は、肺動脈平滑筋の増殖低下、脱文化抑制効果が認められた。肺動脈平滑筋網羅的解析の網羅的解析によりMyh11, Cnn1, Acta2, Tagln, and Myocdの発現の脱文抑制に関連した変化を認めた。
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| Strategy for Future Research Activity |
1.ゲノム編集技術を用いたMCP1受容体のCCR2遺伝子欠損の実験的PAHモデルの影響の評価。周産期低酸素は、胎生14日から生後3日まで14%低酸素暴露を行う。雄の7週齢SDラットに、Sugen投与とその後3週間の低酸素暴露で作成したSuHxラットを、15週齢の時点で、心エコーによる循環評価、心臓カテーテル検査による右室圧、大動脈圧測定後、屠殺し、組織採取を行う。 CCR2遺伝子欠損の有無、周産期低酸素暴露後SuHxの有無の4群で評価と生存率評価を行う。組織採取では、定量的病変評価、免疫染色、realtime PCR、western blotを行う。 2.siRNA、In Silico解析、刺激下の網羅的発現解析を用い て、培養細胞でのPDCLの作用、増殖、炎症活性の細胞内シグナル伝達の解明 7週齢ラットから、実体顕微鏡下で肺内肺動脈の摘出し、内膜、外膜を除去し、小切片を作成。継代培養を行い、PDGF-BBによる増殖刺激、TNF-αによる炎症刺激により遺伝子発現を評価する。培養細胞の刺激後のPDCL遺伝子のsiRNAによる抑制、網羅的遺伝子発現解析、In silicoのpathway 解析、realtime PCR、western blotを行う。炎症性肺高血圧モデル（モノクロタリン刺激）においても、同様の効果を認めつつあり、in vivoおよび肺動脈平滑筋を用いた実験を行う。
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| Causes of Carryover |
網羅的発現解析を予定しているが、その準備実験に時間を要し、その実施が、2022年度から2023年度に変更された為。
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[Journal Article] A registry study of Kawasaki disease patients with coronary artery aneurysms (KIDCAR): a report on a multicenter prospective registry study three years after commencement.2023
Author(s)
Koyama Y, Miura M, Kobayashi T, Hokosaki T, Suganuma E, Numano F, Furuno K, Shiono J, Ebata R, Fuse S, Fukazawa R, Mitani Y
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Journal Title
Eur J Pediatr
Volume: 182(2)
Pages: 633,640
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Analysis of Coronary Arterial Aneurysm Regression in Patients with Kawasaki Disease by Aneurysm Severity: Factors Associated with Regression2023
Author(s)
Kato T, Miura M, Kobayashi T, Kaneko T, Fukushima N, Suda K, Maeda J, Shimoyama S, ShionoJ, Hirono K, Ikeda K, Sato S, Numano F, Mitani Y, Waki K, Ayusawa M, Fukazawa R,
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Journal Title
J Am Heart Assoc
Volume: 12(3)
Pages: e22417
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] CRISPR-mediated Bmpr2 point mutation exacerbates late pulmonary vasculopathy and reduces survival in rats with experimental pulmonary hypertension.2022
Author(s)
Kabwe JC, Sawada H, Mitani Y, Oshita H, Tsuboya N, Zhang E, Maruyama J, Miyasaka Y, Ko H, Oya K, Ito H, Yodoya N, Otsuki S, Ohashi H, Okamoto R, Dohi K, Nishimura Y, Mashimo T, Hirayama M, Maruyama K.
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Journal Title
Respir Res
Volume: 23(1)
Pages: 87
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Perinatal hypoxia aggravates occlusive pulmonary vasculopathy in SU5416/hypoxia-treated rats later in life.2022
Author(s)
Oshita H, Sawada H, Mitani Y, Tsuboya N, Kabwe JC, Maruyama J, Yusuf A, Ito H, Okamoto R, Otsuki S, Yodoya N, Ohashi H, Oya K, Kobayashi Y, Kobayashi I, Dohi K, Nishimura Y, Saitoh S, Maruyama K, Hirayama
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Journal Title
Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol
Volume: 323(2)
Pages: L178, L192
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Presentation] Perinatal hypoxia aggravates occlusive pulmonary vasculopathy in rats later in life: association with epigenetic changes.2022
Author(s)
Hironori Oshita, Yoshihide Mitani, Hirofumi Sawada, Naoki Tsuboya, Junko Maruyama, Noriko Yodoya, Hiroyuki Ohashi, Kazunobu Oya, Yuhei Nishimura, Shinji Saitoh, Kazuo Maruyama, Masahiro Hirayama
Organizer
Association for European Pediatric and Congenital Cardiology
Int'l Joint Research
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