2021 Fiscal Year Research-status Report
Development of a new treatment for lymphatic malformations with COX-2 inhibitors
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21K07851
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
岡本 康裕 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 教授 (30398002)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
児玉 祐一 鹿児島大学, 医歯学域鹿児島大学病院, 講師 (20535695)
中川 俊輔 鹿児島大学, 医歯学総合研究科, 特任助教 (60789973)
西川 拓朗 鹿児島大学, 医歯学域鹿児島大学病院, 講師 (90535725)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | リンパ管奇形 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
初代培養リンパ管内皮細胞に、COX-2を添加して培養した。Tube formationは、非添加時に比べ、面積にして129% (n = 12)に増加した。細胞数は154% (n=12)に増加した。COX-2作用の下流にあるPGE2をPGE2測定CLIA キットで測定すると、COX-2添加時には培養液中のPGE2は2.58倍に増加していた。HIF1αの蛋白発現はWestern blotで1.81倍に増加していた。VEGF120の蛋白発現は2.66倍に増加していた。以上より、COX-2にはリンパ管内皮細胞において、増殖効果があることがわかった。これらの作用は、PGE2―HIF1α―VEGF経路を介していることも推測された。
LM細胞株の樹立：ヒトLMで報告されているPIK3CA変異(p.E542K、よびp.E545A)を組み込んだプラスミッド・ベクターを作成した。エレクトロポレーション(AMAXA(Lonza))を用いて人初代培養リンパ管内皮細胞に遺伝子導入を行った。しかし、エレクトロポレーション後の細胞の増殖は著しく悪く、遺伝子導入を行い、かつ安定して細胞培養を継続する条件は見出せなかった。そこで、マウスの内皮細胞であるRCB1994細胞を用いた。RT-PCRで遺伝子導入率の評価をすると、約30%程度であった。導入されたRCB1994細胞をクローニングし(clone 1, 2, 3)、以下の実験にはclone を用いた。Tube formationは、親株に比べclone 1では、面積にして153% (n = 12)に増加した。細胞数は157% (n=12)に増加した。培養液中のPGE2は2.10倍に増加していた。HIF1αの蛋白発現はWestern blotで1.51倍に増加していた。VEGF120の蛋白発現は2.33倍に増加していた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初代培養細胞に遺伝子導入することはできなかったが、COX-2の作用の確認、LM細胞株の作成ができたので、現在までの進捗は概ね順調である。
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| Strategy for Future Research Activity |
2021年度の結果を踏まえて、COX-2阻害薬の作用機序の解明を行う。前述のRCB1994細胞株clone 1を用いる。培養に、COX-2添加/非添加×COX-2阻害薬添加/非添加で培養を行い、tube formation、細胞増殖を評価する。同様に、PGE2の測定、HIF1α発現の解析、VEGF120発現の解析を行う。
機序の確認のために、テロメラーゼ活性、caspase 3/7活性、annexin発現をそれぞれ解析する。
阻害の救済：COX-2阻害薬によって抑制された増殖を、その下流の因子によって救済できるかどうかを確認する。救済する標的は、培養液中のPGE2とVEGFである。救済の評価として、tube formationアッセイ、細胞増殖アッセイを行う予定である。
引き続き、初代培養リンパ管内皮細胞に対し、遺伝子導入を試みる。
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| Causes of Carryover |
購入予定であった試薬が在庫切れのために、次年度使用額が生じた。
次年度において、速やかに使用する予定である。
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