2021 Fiscal Year Research-status Report
遺伝性胆汁うっ滞疾患に対する全ゲノム解析による新規分子病態の発見と診断率の向上
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21K07854
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
戸川 貴夫 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 講師 (10792814)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 遺伝性肝内胆汁うっ滞症 / 全ゲノム解析 / 染色体構造異常 / トランスクリプトーム解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は2013年から胆汁うっ滞患者約700例に61遺伝子のエクソン領域について網羅的解析を行い，33％で分子遺伝学的診断を確定した．一方で，新生児乳児の未診断例において20％の患者は病原性バリアントを片アレルにだけもつ事を見出した．これは遺伝性胆汁うっ滞疾患に，遺伝子のエクソン領域の異常では説明できない病態がある事を示唆する．本研究は全ゲノム解析により，エンハンサー，プロモーターなどの発現調節領域，深いイントロンの異常，染色体構造異常に遺伝性胆汁うっ滞の新しい分子遺伝学的病態を求める．新たな責任遺伝子，病態の発見により遺伝性胆汁うっ滞の診断率向上と，将来の創薬開発へ研究の展開を目指すものである．
2021年度から2022年度は研究の基本データを取得するため全ゲノム解析と病原性バリアントの抽出を行った．先行して解析を行った対象は以下のように選定した．我々が過去に胆汁うっ滞遺伝子パネル（61遺伝子）を用いて網羅的遺伝子解析を行ったが，分子遺伝学的に診断確定に至らない患者で，かつ血清直接ビリルビンが5.0mg/dL以上の高度の胆汁うっ滞症3例を選定した．この3例について全ゲノム解析の塩基配列決定実験を行った．現在，候補バリアントについて，バイオインフォマティクス，知識データベースを活用して，分子遺伝学的病態解析に妥当なものを選択する作業を行っている．遺伝子コーディング領域やスプライスサイトで明らかな病原性のバリアントは同定されていない．しかし，深いイントロン領域やゲノム構造異常について現在もバイオインフォマティクスを活用して解析に取り組んでいる．尚，症例選定をするための研究成果を論文として発表した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2021年度から2022年度は研究の基本データを取得するため全ゲノム解析，トランスクリプトーム解析と病原性バリアントの抽出を行った．対象は以下のように選定した．我々が過去に胆汁うっ滞遺伝子パネル（61遺伝子）を用いて網羅的遺伝子解析を行ったが，分子遺伝学的に診断確定に至らない患者で，かつ血清直接ビリルビンが5.0mg/dL以上の高度の胆汁うっ滞症3例を選定し全ゲノム解析を行った．現在，候補バリアントについて，バイオインフォマティクス，知識データベースを活用して，分子遺伝学的病態解析に妥当なものを選択する作業を行っている．全ゲノム解析を行うための症例選定について，一部先行研究の結果を含む成果をJPGN Reportで発表した．
今回3例の全ゲノム解析実験を委託業者に委託し，塩基配列は決定できた．遺伝子コーディング領域やスプライスサイトで明らかな病原性のバリアントは同定されていない．しかし，深いイントロン領域やゲノム構造異常について現在もバイオインフォマティクスを活用して解析に取り組んでいる．
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| Strategy for Future Research Activity |
2022年度は解析対象例を増やして全ゲノム解析を行っていく予定である．そして，検出されたバリアントについて機能解析実験の準備を開始する．遺伝子，非コーディング領域，深いイントロンのバリアントごとで推定される分子病態が異なるため以下の様な機能解析実験やバリアントの証明実験を計画している．①スプライシング領域はHEK293T細胞によるミニジーンアッセイを行う．②プロモーター，エンハンサー領域はルシフェラーゼアッセイを行う．③胆汁酸トランスポーターなどの機能タンパクの評価はバリアントを導入し形質転換したHepG2細胞を用い，RNAi法により偽胆管の機能を低下させ，蛍光胆汁酸の排泄量を測定して機能評価する．④肝組織病理はBSEP，MRP2などの肝細胞表面に発現するトランスポーターについて，特殊免疫染色により評価する．⑥染色体構造異常についてはarray CGHなどで確定する．
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| Causes of Carryover |
消耗品の使用が当初の計画よりもやや多かったため．
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