2023 Fiscal Year Research-status Report
Estimation of variant of uncertain significant (VUS) identified in genetic disorders by rapid preparation of model mice
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21K07880
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| Research Institution | Institute for Developmental Research Aichi Developmental Disability Center |
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Principal Investigator |
林 深 愛知県医療療育総合センター発達障害研究所, 遺伝子医療研究部, 部長 (50596244)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / VUS / 疾患モデルマウス / 臨床遺伝学 / 発達障害 / てんかん |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、神経発達症やてんかんなど、主に発達障害を呈する遺伝性疾患のゲノム解析において見いだされる病的意義の不明なゲノム変異 (VUS)を評価し、そのバリアントがタンパク・細胞・組織・生体レベルで引き起こす病態機序を理解することである。この目的のため、ゲノム編集試薬を妊娠マウスの受精卵に直接導入し、遺伝子改変マウスを最短19日で作出する技法であるi-GONAD法により標的とするVUSを正確に模したモデルマウスを迅速かつ正確に作出することによって、当該VUSが個体・組織レベルでどのように遺伝子機能を障害し、発生発達に影響するかを評価してきた。
本年度までの施行により、14遺伝子における16系統のモデルマウス作出に成功し、漸次解析を行っている。一例として、てんかん・発達遅滞の家系例に見いだされたTENM4のスプライシング領域のVUSを挙げる。TENM4のミスセンスまたは機能喪失型変異は本態性振戦の原因となることがすでに知られているが、本症例とは明らかに表現型が異なる。しかし、本VUSを正確に模したマウスモデルはpentylenetetrazole誘発による著明なてんかん感受性の亢進や脳梁の菲薄化を示し、本VUSが表現型の原因となっていることが強く示唆された。本件は現在論文作成中である。
本研究は直接的かつ迅速にVUSがpathogenicであるかbenignであるかを判定する系を構築し、遺伝性疾患におけるゲノム解析の結果をより有効に活用して遺伝性疾患の理解を拡げるものである。また、一つの遺伝子が複数の表現型の原因となる状態である多相遺伝 (pleiotropy)の概念は古くより提唱されていたが、遺伝性疾患における具体的な理解はまだ途上にある。本研究によるgenotype-phenotype連関の知見蓄積により、pleiotropyについての理解も深まることが期待できる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
概ね研究は順調に進展している。申請時の研究計画に沿って進捗状況を示す。
1) 発達障害におけるVUSの収集と解析：前年度に引き続き、研究協力者である臨床遺伝専門医たちとの症例検討などから病的意義の明らかではないゲノムバリアント (VUS)の収集を継続している。今年度は、コレステロール代謝異常に起因する発達遅滞の原因遺伝子候補FDFT1のVUSなどを見出し、解析候補とした。
2) i-GONAD法を用いた遺伝子改変マウスの作出と評価：1)で収集されたVUSを正確に模したモデルマウス作製については、現在までに14遺伝子16系統のマウスの作出に成功した。一部マウスは戻し交配を行い、蛋白・細胞・神経病理の評価ならびに行動解析を施行している。昨年度より解析を継続していたてんかん・発達遅滞を呈する家系例に見出されたTENM4におけるスプライシング領域のVUSは、本VUSを正確に模したモデルマウスの解析により、薬剤誘発の痙攣に対する有意な感受性増加、脳梁の菲薄化など、病態を説明し得る表現型の異常を生体レベルならびに組織レベルの両方で明らかにすることができた。現在論文作成中である。また、同様に、自閉傾向を伴う発達遅滞症例に見られたCTNND2の挿入変異についてもマウスモデルの作製並びに解析を行ったところ、著明な活動性低下という発端症例に類似する表現型を呈した。本例についても病態との関連探索を継続している。
3) CRISPR/Cas9を用いたモデル細胞作製：Mowat-Wilson症候群の原因遺伝子であるZEB2の制御・被制御因子を探索する目的で、ゲノム編集による神経芽細胞腫セルラインのZEB2ノックアウト株を作製し、解析を継続している。また、ZEB2に良好な抗体がないことを受け、i-GONAD法を用いてZeb2にHAタグを接続したマウスモデルを作製し、ZEB2制御因子の探索に用いている。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究最終年度である前年度は、先行して得られたモデルマウスの表現型評価を概ね計画通りに進行することができた。論文の完成に至っていないため、延長期間である今年度は論文の完成を目標に、適宜必要な追加実験などを行う。
具体的に論文化が進んでいるTenm4のVUSを有するモデルマウスについては、現在脳梁菲薄化を来す組織学的検討を行っており、本データを加えて論文完成とする予定である。また、同様に論文化が進んでいるCtnnd２については、著明な活動性の低下を説明するための神経組織学的探索を行っており、その結果に応じて論文完成とする予定である。
その他、i-GONAD法で作成した数系統のマウスの表現型解析を適宜進行させ、これらについても論文化を目指す。また、本研究で得られた新規のgenotype-phenotype連関は発達遅滞における多相遺伝的な状態を理解するエビデンスとなることから、論文化の他にも公的データベースへの登録などを通じ、新規病態の周知に努め、未診断例への寄与を目指す。
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| Causes of Carryover |
研究のとりまとめと論文完成・投稿のために、追加実験や英文校閲などにかかる一定額の使用が見込まれたため、次年度使用額が生じた。
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[Journal Article] Pathogenicity evaluation of variants of uncertain significance at exon-intron junction by splicing assay in patients with Mowat?Wilson syndrome.2023
Author(s)
Suzuki Y, Nomura N, Yamada K, Yamada Y, Fukuda A, Hoshino K, Abe S, Kurosawa K, Inaba M, Mizuno S, Wakamatsu N, Hayashi S
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Journal Title
European Journal of Medical Genetics
Volume: 66
Pages: 104882
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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