萎縮性胃炎オルガノイドからの腸上皮化生、腸型胃がん発がんモデルの構築

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K07915
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 有山 寛 九州大学, 大学病院, 助教 (80713437)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: LGR5 / WNT / BMP / SMAD4

Outline of Annual Research Achievements

これまでの臨床検体での解析から健常部ではLGR5陽性細胞は検出困難であったが、萎縮性胃炎では有意にLGR5発現細胞が増加しており、萎縮性胃炎から樹立したオルガノイドも多くがLGR5陽性であった。オルガノイド培養系においてWnt3a、Nogginを添加しない場合はオルガノイド形成が見られず、オルガノイド形成及びLGR5陽性細胞の維持にはWNTシグナルが必須であった。臨床検体においては腺底部にWNT3aを発現する細胞が認められ、現在免疫染色を行い、これらWnt3a発現細胞の同定を行っている。
LATS2 KOによる腸上皮化生のメカニズムとして、LATS2ノックアウト後に定量的PCRによりID4の発現亢進を認め、BMPシグナルの関与が示唆された。
LATS2またはRUNX3のみのノックアウトではマウスにおける造腫瘍性を確認できなかったが、これらのノックアウトに加えてTP53あるいはSMAD4をノックアウトすることで、マウスにおける造腫瘍性が確認できた。さらにTP53と比較して、SMAD4 double knock outオルガノイドを移植した場合では、腫瘍内に浸潤するCD68陽性マクロファージの有意な増加とCCL2の mRNA発現が亢進しており、腸型胃がんにおける炎症性の微小環境構築にSMAD4が関与する可能性が示唆された。
コヒーシン構成分子の異常による染色体不安定性の誘導を目的に、胃がんAGS細胞株を用いて予備実験を行った。STAG1遺伝子をCRISPR-Cas9システムで用いてノックアウトし、染色体不安定性をmFISHで解析を行ったが、STAG1遺伝子のノックアウトによる染色体異常の増加は認めなかった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

昨年度と同様これまで使用していたCorning社のマトリゲル基底膜マトリックスの供給停止によりオルガノイド培養研究が遅滞している。
引き続き代用品も検討したが、オルガノイドの継代培養が行えず、またこれまでの培養条件と異なるため、研究結果の同質性に問題があり、マトリゲルの再供給を待つ必要がある。
一方で新しい胃オルガノイドの培養系確立を目指し、条件検討を引き続き行い、これまでと同様の結果が得られることの確認を行っていく。
また、現在これまでのin vitroでの結果を免疫染色によりヒト検体にて確認を行っている。

Strategy for Future Research Activity

マトリゲルの供給停止が続く場合、ヒト臨床検体での解析並びにこれまでのオルガノイド培養系のブロック標本を用いて、WNT・BMPシグナルの解析を継続し、論文化を目指す。
マトリゲルの供給が可能となった場合、あるいは胃オルガノイドの新しい培養系を確立した場合は引き続きKOの系を用いて、萎縮性胃炎におけるBMPシグナル特にID4の機能や胃癌進展における微小環境の変化に及ぼすSMAD4の役割につき検討を行っていく。

Causes of Carryover

マトリゲルの供給停止が続き、代用品を検討したがこれまでの培養条件に沿うものがなかったため、次年度使用額が生じた。マトリゲルの供給再開に伴う物品または同様の物品購入に使用する計画である。