2022 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of the onset site and pathological progression process of ulcerative colitis in model mice with luminescence reporter gene
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21K07917
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
入江 厚 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 講師 (30250343)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
竹田 直樹 熊本大学, 生命資源研究・支援センター, 助教 (90304998)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 潰瘍性大腸炎 / 小胞体ストレス / 発光レポーター / HLA-DR / Akaluc / ERAI |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者らが樹立したヒト白血球抗原HLA-DR4のトランスジェニックマウス（以下 HLA-DR4tgm ）のホモ接合体は、潰瘍性大腸炎様の炎症性腸疾患を自然発症する。これまでの研究からこの疾患の病因には、HLA-DR4分子の過剰発現による小胞体ストレスと、SPF対象外の腸内細菌（ Helicobacter japonicus ）の関与が示されている。
この疾患の病態を可視的に観察するため、ルシフェラーゼの改良型である Akaluc を用いる大腸特異的な小胞体ストレスを検出する発光レポーター遺伝子（ER stress-activated indicator-Akaluc, ERAI-Akaluc ）約13kbを構築した。このレポーター遺伝子をB6J 受精卵にインジェクションし、そのトランスジェニックマウスを樹立した。ついで当該マウスと既存のHLA-DR4tgmとの交配を開始した。
いっぽう、抗生剤処理をしてヘリコバクター種を駆除した HLA-DR4tgm のホモ接合体に、単体培養した H. japonicus を投与することにより、人為的に上記病態を再現できることから、H. japonicus は当該病態の起因菌の１つと考えている。当初H. japonicusの安定した培養は困難であったが、試行錯誤の末、微好気環境下での羊脱繊維血液入り寒天培地による培養法を確立した。
これによりERAI-Akalucを持ち、かつHLA-DR4トランスジーンのホモ接合体を樹立し、抗生剤投与により内在性のヘリコバクター種を駆除した後、培養したH. japonicusを経口投与した。当該マウスはH. japonicus投与後に体重減少、下痢等の症状を呈した。これらのマウスにAkalucの基質であるアカルミネを腹腔内投与後、in vivo イメージングシステムにより大腸部の発光を観察した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
HLA-DR4とERAI-Akaluc、両トランスジェニックマウスを交配し、ERAI-Akalucを持つHLA-DR4ホモ接合体を樹立した。これらのマウスは起因菌の１つと考えているH. japonicusの経口投与により大腸炎症状を呈した。しかしながらAkalucの基質であるアカルミネの腹腔内投与後の患部の発光が、期待したほど明るくならないことが判明した。
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| Strategy for Future Research Activity |
ERAI-Akalucの活性によるアカルミネの発光が期待したほど明るくないため、その原因と対策を講ずる。具体的にはアカルミネの投与を静注、あるいは経口に変更し、発光が改善されるか検討する。
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| Causes of Carryover |
大腸特異的なAkalucの活性による発光がそれほど強くなく、原因と対策の検討を行った。そのためAkalucの基質であるアカルミネとin vivoイメージングシステムの使用、およびマウスの飼育数が予定計画より少なかったため次年度使用額が生じた。
今後は検討した対策を講じて22年度使用予定分を、アカルミネの購入、in vivoイメージングシステムの使用、マウスの繁殖に使用する。また翌年度（最終年度）分は当初計画通りアカルミネの購入、in vivoイメージングシステムの使用料、マウス飼育費とともに、起因菌培養費用、病理組織解析費用に使用する。
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