2023 Fiscal Year Research-status Report

がん細胞のインターフェロンシグナルを制御する長鎖noncoding RNAの解析

Research Project

Project/Area Number	21K07945
Research Institution	Sapporo Medical University
Principal Investigator	新沼猛札幌医科大学, 医学部, 講師 (60708113)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	鈴木拓札幌医科大学, 医学部, 教授 (20381254)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2025-03-31
Keywords	long noncoding RNA / 消化器がん
Outline of Annual Research Achievements	消化器癌におけるDLEU1の機能解析を行うために大腸癌細胞株を用いてDLEU1をノックダウンし細胞増殖に与える影響についてcell viability assayを行った。大腸癌についてはいずれの細胞株においてもDLEU1のノックダウンは細胞増殖を抑制した。DLEU1のノックダウンがIFNシグナルに与える影響を調べるためにDLD1、SW480においてIFITM1、IFITM3の発現をRT-qPCRにて解析したところ、口腔扁平上皮癌と異なり、これらのISGｓは発現が不変～上昇傾向であった。ISGｓに与える影響についてもRT-qPCRにより解析したが、一定の傾向を示さなかった。口腔がん細胞株の遺伝子発現マイクロアレイ解析からDLEU1のノックダウンはIL1の発現を減少させる結果が得られており、qRT-PCRによる解析においても同様の結果が得られた。レンチウイルスを用いたDLEU1の過剰発現系においてはIL1の発現上昇が認められた。アクチノマイシン添加による解析の結果、DLEU1の過剰発現によりIL1のmRNA安定性が亢進する事が確かめられた。反対に、DLEU1のノックダウンではIL1のmRNAの安定性が低下しており、DLEU1はIL1の安定性に関与することでその発現上昇に寄与する事が推察された。レポーターアッセイによるNFKBシグナル経路の活性について解析した結果、DLEU1の過剰発現によりNFKBシグナルの亢進が認められた。ウエスタンブロットでもDLEU1過剰発現によるリン酸化p65の亢進が確認され、DLEU1がNFKBシグナル経路の活性化を介してIL1の発現上昇させることが推察された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 大腸癌においてはDLEU1のノックダウンにより口腔扁平上皮癌での解析と同様に、細胞増殖が抑制される結果であったが、IFNシグナルに与える影響は少ないと考えられた。食道癌においてはDLEU1のノックダウンが細胞増殖に与える影響については口腔扁平上皮癌と異なると考えられ、IFNシグナルに与える影響においても異なっていた。口腔がん細胞の解析からはDLEU1はNFKBシグナル経路の活性化とmRNAの安定性に寄与する事で、IL1の発現を上昇させる事が示唆された。以上からDLEU1はIL1の発現上昇を介しISGｓの発現を制御する事が示唆されたため、今後更なる解析を行う事とする。
Strategy for Future Research Activity	DLEU1のNFKBシグナル、IL1を介したISGｓの制御機構について更なる解析を行う。STATのリン酸化についてウェスタンブロットによる解析、またはレポーターアッセイによる解析を行う。IL1B添加によるISGｓの誘導がIL1受容体のノックダウンにより抑制されるかをqRT-PCRを用いた発現解析を行い検証する。またIL1添加による遺伝子発現変動についてRNA sequencingを行い解析する。また、他の消化器がん細胞株を用いた機能解析、IFNシグナルに与える影響についても解析を継続する。その際にはIL1による制御機構が存在する可能性についても解析を行う。
Causes of Carryover	大腸癌、食道癌細胞株を用いてDLEU1がインターフェロンシグナルに与える影響を解析したが、口腔扁平上皮癌とは異なり、大腸癌・食道癌においてはDLEU1がISGｓの発現に与える影響は少ないと考えられた。そのため遺伝子発現をマイクロアレイなどで、ヒストン修飾状態をChIP-sequencingにより網羅的に解析する予定であったが行えなかった。口腔がん細胞を用いた解析からDLEU1にはNFKBシグナル、IL1を介したISGｓの制御機構が存在する可能性が示唆されたため、まずは口腔がん細胞を用いた解析を継続するととともに、胃癌細胞株、膵癌細胞株、肝がん細胞株などを用いた解析を継続する。これらの細胞株を用いて、RNAシークエンスによる網羅的な遺伝子発現解析、ChIPシークエンスによるヒストン修飾の解析などを行う予定である。また遺伝子発現解析試薬・レポーターアッセイ試薬類・細胞機能解析試薬類の購入を予定している。