2022 Fiscal Year Research-status Report
腸管粘膜透過性を制御するB細胞機能の解析とクローン病の病態解明
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21K07961
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| Research Institution | Shimane University |
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Principal Investigator |
石原 俊治 島根大学, 学術研究院医学・看護学系, 教授 (80263531)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
三島 義之 島根大学, 学術研究院医学・看護学系, 助教 (30397864)
岡 明彦 島根大学, 学術研究院医学・看護学系, 助教 (80600600)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 腸管粘膜透過性 / クローン病 / 制御性B細胞 / 制御性T細胞 / IL-10 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまで私共は、クローン病（CD）では、制御性B細胞（Breg）の機能が減弱していること、dysbiosis環境下では組織の細胞外アデノシン三リン酸（ATP）がBregの機能を低下させること可能性を明らかにしてきた。一方、腸管粘膜透過性は多彩なメカニズムによって担われているが、Bregによる粘膜透過性制御に関する報告はこれまでにない。本研究課題では、「CDにおいては、Bregの異常が腸管粘膜透過性の制御機能を低下させ、腸管炎症増悪に関与する」という仮説を立て、種々の実験モデルを用いてこの仮説を検証することを目的とした。本研究の成果は、CDの病態と“leaky gut syndrome”の病態解明につながる可能性があり、これまでと異なる視点からの診断法や治療法の開発に貢献できると考える。
本申請課題では、これまでのBregに関する研究成果を踏まえて、「Breg においてIL-10産生の低下が認められるCD患者では、その機能異常によって腸管粘膜透過性の制御機能が低下し、結果的に不可逆的な慢性炎症が誘導されること」を明らかにする。遺伝子操作マウスおよび免疫不全マウスであるRAG2-KOを用いたin vivoでの腸炎モデルの実験系、さらにin vitroにおいては、腸管上皮と免疫細胞の共培養系を樹立し、Bregの機能低下によって上皮の粘膜透過性が低下することを目的として研究を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1. マウスモデルを用いた腸管粘膜透過性
レシピエントとして免疫不全マウスであるRag2-KOマウスを実験に使用した。野生型マウス（C57BL/6）の脾臓からTおよびB細胞を分離調整し、Rag2-KOマウスの腹腔内に投与し、投与4週間後に腸管粘膜透過性をFITCデキストラン法によって評価した。現在までの検討では、T細胞の移入時に比べて、B細胞の移入時に腸管粘膜透過性が低下する傾向を認めた。本結果から、B細胞が粘膜透過性を制御する可能性が示唆されたが、そのメカニズムにBregの機能が関与するか否かが不明であり、次年度ではBregの移入の有無による新たなモデル作成によって腸管の粘膜透過性を詳細に検討する必要がある。
2. In vitroモデルによる評価
In vitroにおける腸管透過性制御モデルは、trans-wellのapical側に大腸上皮であるCaco-2細胞を培養し、basolateral側にT細胞とB細胞を共培養するモデルを作成し、T細胞とB細胞が上皮の粘膜透過性に与える影響を検証した。培養上皮の透過性は上皮間電気抵抗を測定することで評価した。本検討では、T細胞よりもB細胞と共培養した際に上皮の透過性が低下することが確認され、本結果はin vivoのマウス移入モデルの結果を反映する結果であった。今後はマウスモデル同様に、本変化がBregの機能に依存したものであるかを評価する必要があり、次年度では新規のモデルを作成することで検証していく。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. マウスモデルを用いた実験系
2022年度の実験で、Rag2-KOマウスにリンパ球を移入して腸管粘膜透過性を評価するモデルは樹立できているので、2023年度は、さらにBregの関与を検討していく。現在、私共はIL-10-KOマウスを飼育しており、実験に使用可能な状況である。IL-10-KOマウスの脾臓から分離したB細胞はIL-10に依存した免疫抑制機能を失っていることから、本マウスのB細胞をRag2-KOマウスへの移入する系を用いて、野生型B細胞の移入系と比較することによって腸管粘膜透過性の制御におけるBregの関連を明らかとする。また、非炎症時のみならず、B細胞移入モデルにデキストラン硫酸ナトリウムによって腸炎を惹起し、腸炎誘発時におけるBregの粘膜透過性の制御機能を評価する。
2. In vitroモデルによる評価
In vitroにおける腸管透過性制御モデルは、2022年度と同様にtrans-wellのapical側にCaco-2を培養し、basolateral側にB細胞を共培養する系を用いていく。2023年度は、野生型とIL-10-KOマウスから分離したB細胞を各々上皮細胞と共培養する系を作成し、腸管粘膜透過性の制御におけるBregの関連を明らかとする。In vivoと同様に、TNF-alphaで腸管に傷害を与えることで粘膜透過性を亢進させたモデルも作成し、Bregの影響を検証する。さらに、ヒトCD患者および健常人から分離したB細胞を、各々Caco-2と共培養し、上皮細胞の透過性亢進に与える影響を検討する。
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| Causes of Carryover |
2023年度も継続して、マウスモデルを用いた実験系、in vitroの共培養系を樹立し、概ね計画通りに研究は遂行してきた。予算も概ね予定通りの使用となったが、マウスや一部の試薬などは、他の実験者と共有できることもあり、未使用額が生じた。
2023年度も、継続してマウスモデルとin vitroの共培養系を用いた研究を遂行していくので、2022年度の残予算は実験動物、分子生物学的試薬などに充てて、さらに詳細に研究を進めていく。
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