2021 Fiscal Year Research-status Report
癌促進型分岐点の制御に着目した新規食道癌治療の分子基盤
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21K07971
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| Research Institution | Kawasaki Medical School |
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Principal Investigator |
増田 清士 川崎医科大学, 医学部, 教授 (00457318)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | RNA結合蛋白質 / 食道扁平上皮癌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
TIA1aが鍵となる癌促進型分岐点を介してESCC促進的に働く分子機構の全容を解明するために、本年度はTIA1の細胞内機能制御メカニズムに着目した。特にTIA1a蛋白質の細胞内局在が重要であるとの仮説の元、検討を行った。TIA1aまたはTIA1b蛋白質に核移行シグナルを付加したコンストラクトを作成し、食道癌細胞株に遺伝子導入したところ、核移行型TIA1a蛋白質を発現した細胞はコントロール細胞に比べて増殖が抑制された。また、TIA1の標的mRNAとして報告しているSKP2およびCCNA2蛋白質の発現量が有意に抑制された。一方、野生型TIA1bは主に核内に発現しており、核移行型TIA1bを遺伝子導入しても細胞の形質に変化は見られなかった。このことからTIA1アイソフォームの細胞内機能の違いは、細胞内局在の違いに由来すると考えられた。
次に、TIA1aの細胞内局在を制御する機序として、これまで他のRBPで明らかとなっているアミノ酸のリン酸化に着目した。TIA1aにのみ存在するヒンジ領域には蛋白質構造や機能を調節するdisordered sequenceが内在する。同部位及びこの周囲に存在するSer/Thr を各々アラニンに改変した非リン酸化型TIA1aを用いた検討で、TIA1aが細胞質から核へ移行するコンストラクトを複数見いだした。また、同アミノ酸をアスパラギン酸に改変したリン酸化型TIA1aでTIA1aがより細胞質に移行した。さらにヒンジ領域のアミノ酸配列から予測されるキナーゼリストを作成し、特異的阻害剤やsiRNAを用いた検証で、局在調節キナーゼ候補として複数の遺伝子を同定した。現在、これらの候補キナーゼについて詳細に検討を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度に計画していた「TIA1aの機能・局在制御機構の解明」として、TIA1aの局在によって細胞内機能が変化すること、またTIA1aの細胞内局在を制御するアミノ酸配列を特定した。また、複数のデータベースより特定したアミノ酸のリン酸化を制御するキナーゼ候補を同定し、特異的な阻害剤で細胞を処理するとTIA1aが細胞質から核内に移行することを明らかにすることができた。このことから、おおむね順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
1) TIA1遺伝子の選択的スプライシング制御機構を明らかにする。TIA1遺伝子のexon 5領域を含むcDNAをテンプレートとして、BrUTPで標識したRNAを in vitro合成し、抗BrdU抗体を用いてBrU-RNA-RBP複合体を回収する。回収したRNP複合体をSDS-PAGEで分離・展開後、質量分析を行い、TIA1遺伝子の選択的スプライシングを制御するRBP候補リストを作成する。さらに候補RBP群のノックダウンや強制発現系で、スプライシングパターンの解析をミニジーンで行い、TIA1遺伝子の選択的スプライシングを制御する複合体の特定とその結合DNA領域を明らかにする。
2) 2021年度及び2022年度の結果からTIA1aの癌促進機能を制御する候補点を絞り込み、有効な介入法を検討する。介入法の検索は、TIA1a安定強発現細胞株を用いたTIA1aの細胞内局在解析または細胞増殖能解析を用いる。現時点では、介入法の候補としてエクソンスキップ、特異的siRNA、キナーゼ阻害、相互作用するmRNAの作用部位修飾、機能モジュールのハブとなる因子の阻害に加え、ヒンジ領域配列を含む合成ペプチドによる細胞内局在調節性相互作用因子の阻害やスポンジ因子によるTIA1aトラップを予定している。
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| Causes of Carryover |
（理由）
本年度に実施する予定であった質量分析に使用するサンプルが、従来の免疫沈降法では充分量確保できず、来年度に延期したため、「その他（解析委託費）」の項目で差額が生じた。また、コロナ禍の影響もあり、情報収集目的で参加予定であった学会がオンライン開催されたため、旅費に差額が生じた。
（使用計画）
次年度は、TIA1遺伝子のスプライシング制御因子を同定するためにRNA-seqを行うとともに、アンチセンスオリゴや低分子ペプチドの合成、キナーゼ阻害剤スクリーニングを行うために、本年度未使用であった助成金と次年度分として請求した助成金を合わせて使用する。
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