2022 Fiscal Year Research-status Report
消化管上皮幹細胞における古典的WNTシグナル伝達経路の多様性に関する研究
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21K07972
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| Research Institution | University of Occupational and Environmental Health, Japan |
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Principal Investigator |
土井 知光 産業医科大学, 医学部, 講師 (70437218)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 幹細胞 / βカテニン / p300 / CBP / タンパク質間相互作用 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
古典的WNTシグナル伝達経路は、β-cateninを介して転写制御を行うことで、消化管幹細胞の維持、分化において中心的役割をしている。しかし、幹細胞から分化する過程でWNTシグナルの標的遺伝子が切り替わる仕組みは明らかになっていない。申請者はこれまでに、β-cateninと結合するコアクチベーターがCBPからp300にスイッチすることで、標的遺伝子が切り替わることを示した。そこで本研究ではさらに発展させ、（１）上皮幹細胞及び分化過程における、β-cateninコアクチベーターの切り替えの解析、（２）β-cateninコアクチベーター切り替えを誘導するタンパク質間相互作用阻害剤のスクリーニングと、その標的分子同定、そして（３）阻害剤の組織修復、癌幹細胞増殖への作用を明らかにすることで、消化管上皮幹細胞及び分化過程における異なるβ-catenin複合体の役割を明らかにする。
初年度、申請者はβ-cateninとコアクチベーターp300の複合体が核内に観察される細胞集積が、小腸上皮陰窩底部に認められることを明らかにした。昨年度は、化合物スクリーニングの指標細胞の選定を行った。当初、β-cateninとp300及びCBPのゲノム 上での結合領域の解析に用いた膵癌細胞株PANC-1を用いる予定であったが、β-cateninの誘導剤CHIR-99021やβ-cateninとCBPの結合阻害剤ICG-001を作用させた時の、分化状態に変化が無く、幹細胞能と分化応答の切り替えを制御する化合物のスクリーニングには適さないことがわかった。そこで、他の細胞株を検討した結果、腎癌細胞株Caki-1がCHIR-99021に応答して、近位尿細管分化マーカーであるL T Lレクチンの染色性を示すことを見出した。そこで本年度は、Caki-1細胞を用いて、化合物のスクリーニングを実施する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
用いる予定であった膵癌細胞株PANC-1では、β-cateninの誘導剤CHIR-99021やβ-cateninとCBPの結合阻害剤ICG-001を作用させた時の、分化状態に変化が無く、幹細胞能と分化応答の切り替えを制御する化合物のスクリーニングには適さないことがわかった。また、当初、阻害剤の効果をβ-cateninとp300の結合を指標にスクリーニングする予定であったが、結合を検出する近接ライゲーションアッセイを用いることが困難であった為、CHIR-99021によって分化マーカーを発現する腎癌細胞株Caki-1を用いてスクリーニングする事になった。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は、既に６８５９化合物の提供を受けており、Caki-1を用いて化合物のスクリーニングを行う。ヒット化合物に対して、分化能、幹細胞の増殖などに対する効果の検討を行う。更に、ヒット化合物をbiotin化することで、標的分子を同定し、幹細胞、癌細胞の分化に関わる因子の解明を目指す。
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| Causes of Carryover |
年度末に発注した試薬の割引率が反映されていなかった為、当該助成金が生じた。試薬の値上がり等で相殺される為、使用計画に変更はない。
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