2022 Fiscal Year Research-status Report
C型肝炎ウイルスおよび新型コロナウイルス複製に必要な膜小胞の形成メカニズムの解析
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21K07974
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| Research Institution | National Institute of Infectious Diseases |
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Principal Investigator |
相崎 英樹 国立感染症研究所, ウイルス第二部, 室長 (00333360)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | C型肝炎ウイルス / 新型コロナウイル / doble membrane vesicle / NS5A / サブゲノミックレプリコン / HSD11 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、C型肝炎ウイルス(HCV)をモデルとしてdoble membrane vesicles (DMV)形成に関与する宿主因子を見出し、DMV形成のメカニズムを明らかにすることである。HCVのDMV形成についてはNS5AがDMV形成に必須なことが知られている。そこで、Huh7細胞にサブゲノミックレプリコンを導入し、NS5Aで免疫沈降反応を行なって、プロテオーム解析を行なったところ、NS5A結合タンパクとして11β-Hydroxysteroid dehydrogenase (HSD11)を見出した。さらに、脂肪滴周辺膜の比較プロテオーム解析からもHSD11を見出し、HSD11がウイルス粒子産生に重要な役割を持つことを示した。HSD11は多くの臓器に広く分布している。一方、HSD13はHSD11と近い構造を持ち、機能も類似しているが、肝細胞に主に存在している。そこで、HSD13とHCV粒子形成の関連性を調べている。
SARS-CoV-2に感染したVero細胞及び腸管オルガノイドからRNAおよびDNAを抽出し、qRT-PCR、qPCRを行った結果、RNAとDNAの両方からウイルス遺伝子の増幅が観察された。また、COVID-19罹患後の大腸検体を用いた解析でも、RNAとDNAの両方からランダムに増幅されていることが明らかになり、SARS-CoV-2が逆転写される可能性が示唆されている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでの研究から、HSD11の脂肪滴局在性がHCV粒子産生に重要な役割を果たす可能性が示唆された。HSD11は多くの臓器に広く分布している。一方、HSD13はHSD11と近い構造を持ち、機能も類似しているが、肝細胞に主に存在している。そこで、HSD13とHCV粒子形成の関連性を調べるため、HSD13欠損細胞株を作製した。さらに、HSD13の脂肪滴局在シグナル欠損、酵素活性欠損など14種類のプラスミドを作成した。その後、レンチウイルスを用いて、野生型HSD13を含めて、HSD13欠損株に戻した細胞株を作成し、GFPの発現により、レンチウイルスでのHSD13及びそれら変異体の導入を確認した。
SARS-CoV-2を感染させたVero細胞及びから腸管オルガノイドからRNAおよびDNAを抽出し、それぞれqRT-PCR、qPCRを行なったところ、RNAからだけでなくDNAからもN遺伝子の増幅が観察された。さらに、感染Vero細胞からRNA、DNAを抽出し、SARS-CoV-2の全長を網羅的に増幅させる９８種類のプライマーを用いて増幅し、イルミナシークエンサーでシークエンスを行なった。得られたリードをヒトゲノムにマッピングし、マップされなかったリードをSARS-CoV-2にマッピングするという手法で解析したところ、RNAではほぼゲノム全長にわたって増幅されており、一方でDNAでもランダムに増幅箇所があることが明らかになった。COVID-19罹患後の大腸検体を用いて同様の解析を行ったところ、増幅箇所に規則性や共通性はないが、RNA、DNAともにランダムに増幅されていることが示された。これらのことはSARS-CoV-2が逆転写されている可能性が示唆される。
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| Strategy for Future Research Activity |
HCV粒子形成におけるHSD11の役割として、酵素としての活性、脂肪滴周辺膜への結合タンパクの輸送作用が想定された。さらに、興味深いことに、HSD13は肝臓の線維化に関与していることが報告されている。HSD11またはHSD13欠損細胞を作成し、そこに酵素活性欠損、脂肪滴局在シグナル欠損等の各種HSD11, 13の欠損体を発現させることにより、それぞれの機能がHCVの生活環にどのように関わっているか検討する。
さらに、SARS-CoV-2感染患者組織からRNAおよびDNAを抽出し、細胞内におけるSARS-CoV-2の存在様式について次世代シークエンサーを用いて遺伝子発現解析を行なう。今後は逆転写される機序をホストのレトロトランスポゾンに注目して解析する予定である。
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| Causes of Carryover |
当初、HSD11がウイルス粒子産生に重要な役割を持つことを示した。HSD11は多くの臓器に広く分布している。一方、HSD13はHSD11と近い構造を持ち、機能も類似しているが、肝細胞に主に存在しているため、肝臓での病態に関与している可能性が考えられる。そこで、HSD13とHCV粒子形成の関連性についても解析を新たに始めたため、次年度使用額が生じた。
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[Presentation] Hepatocellular organellar abnormalities following elimination of hepatitis C virus2022
Author(s)
Haruyo Aoyagi, Hiroko Iijima, Minami Kikuchi, Mami Matsuda, Koichi Watashi, Ryosuke Suzuki, Takahiro Masaki, Noritomo Shimada, Keizo Kato, Akihito Tsubota, Ayako Mimata, Yuriko Sakamaki, Shizuko Ichinose, Masamichi Muramatsu, Kenjiro Wake, Masaya Sugiyama, Masashi Mizokami, Takaji Wakita, Hideki Aizaki.
Organizer
28th International Symposium on Hepatitis C Virus, Flaviviruses, and Related Viruses
Int'l Joint Research
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