間葉系幹細胞由来の細胞外小胞の保存法の確立と急性肝不全に対する新規治療法の開発

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K07998
• Research Institution: Yamagata University
• Principal Investigator: 芳賀 弘明 山形大学, 医学部, 講師 (70466613)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 星川 恭子 山形大学, 医学部, 助教 (20613053) ; 勝見 智大 山形大学, 医学部, 助教 (70637355)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: Extracellular Vesicles / 間葉系幹細胞 / 急性肝不全

Outline of Annual Research Achievements

劇症肝炎を含む急性肝不全は死亡率が高く、肝臓移植に代わる治療の開発が待たれているが、まだ、十分な効果のある治療法は開発されていない。細胞から放出される細胞外小胞であるExtracellular vesicles(EV) 内にはprotein、RNA、DNAなどが含まれており、細胞間のコミュニケーションに重要な役割を持っていると考えられている。私たちは間葉系幹細胞由来のEVを用いた急性肝不全の治療の開発を目指している。しかし、間葉系幹細胞の培養液からMSC-EVを抽出するには時間がかかるため、緊急性を有する臨床においてはMSC-EVの有効な保存方法の確立が必要である。本研究では、急性肝不全に対して有効な生理活性を持つMSC-EVの保存法の確立を目的とした。
2021年度は間葉系幹細胞の培養液から、Ultracentrifugation法にてExtracellular Vesicles(EV)の採取を行い、それらのEVをナノ粒子解析装置やexosomeマーカーの検討からexosomeの豊富なEVであることが判明した。
さらに、MSC-EVを－60℃で保存し検討したところ、EV数は1か月後に20％ほど減少したが、3月後では変化は見られなかった。またEVのサイズには1か月後、3か月後に変化はなく、EVにおけるexosomeの割合も有意な変化は見られなかった。これらの保存されたEVを急性肝不全マウスモデルに－60℃で保存したMSC-EVを投与したところ保存期間1か月、3か月のMSC-EVとも急性肝不全マウスの生存期間を延長を認めた。今後は、凍結乾燥保存での検討を行う予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

MSC-EVを凍結乾燥保存させて、そのEVの解析まで行いたかったが、凍結乾燥機の準備が間に合わなかった。

Strategy for Future Research Activity

新年度は、MSC-EVの凍結乾燥保存での検討を行う。検討方法は、NanoSightでEV数を、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）, 透過電子顕微鏡（TEM）で形態学的な変化を観察する。さらに液体クロマトグラフィー質量分析 (LC/MS)にて蛋白の変化も検討する予定である。

Causes of Carryover

凍結保存での検討が遅れているため、試薬が2022年度に持ち越しとなったため。