2021 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of immune response mechanisms of CTL and NK cells in HBV infection HBV infection
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21K08006
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
柘植 雅貴 広島大学, 自然科学研究支援開発センター, 講師 (50448263)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | B型肝炎 / 免疫応答 / ヒト肝細胞キメラマウス / 抗ウイルス効果 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
マウス肝細胞の90%以上がヒト肝細胞に置換されたヒト肝細胞キメラマウス（以下、キメラマウス）に対し、B型肝炎ウイルス（HBV）genotype Cキャリアから採取した血清を接種し、HBV持続感染キメラマウスを作製した。非感染マウス、感染3日後、10日後、5週間後、8週後、32週後ににマウスをsacrificeし、肝組織からヒト肝細胞領域を採取。同組織のtotal RNAを抽出後、次世代シークエンス解析を実施した。
HBV感染後、マウス血中のHBV DNA量は感染6～8週目にプラトーに達することから、非感染マウスの肝組織とHBV感染8週後のマウス肝組織における遺伝子発現の相違を検討した。
これらの比較により、両マウス群間で有意に発現が変化し、かつ2倍以上の発現変化を認めた遺伝子は225遺伝子。さらに、microRNAやpseudo geneを除いた結果、196遺伝子が抽出された。そこで、これらの遺伝子情報を検索し、膜蛋白として28遺伝子、分泌蛋白として37遺伝子を抽出した。そこで、これらの発現変化について再現性を確認するため、HBV genotype Aキャリアの血清を接種し作製したキメラマウスの肝組織を用いて同様の解析を実施した。その結果、196遺伝子中132遺伝子においてHBV genotype A感染後も肝細胞内で有意な発現変化が得られた。さらに、これらの遺伝子について遺伝子情報を検索したところ、膜蛋白を14遺伝子、分泌蛋白を24遺伝子を認めた。現在、HBV genotype Aおよびgenotype C感染で共通して発現変化が認められた遺伝子を中心に解析を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究実施施設の移動があったため、実験室を新たに整備する必要があったことに加え、COVID-19などの影響で、実験機器の入手に時間を要し、実験室整備が遅れ、研究進捗に影響が出た。
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| Strategy for Future Research Activity |
2022年3月上旬に実験機器の搬入があり、学内での実験室登録が完了したため、組換えDNA実験計画書の承認が得られ次第、抽出した遺伝子の機能解析を開始する予定である。
HBVクローンや使用したヒト肝細胞に影響を受けない遺伝子・蛋白の同定を行うため、これまでに行った複数回の遺伝子発現解析データを統合して解析しており、次世代シークエンサ機器や解析日の相違によるデータのブレを考慮し、抽出された遺伝子に関してはreal time PCRを行い、再現性を確認する。
次世代シークエンスデータより抽出された遺伝子の中には、機能未知の遺伝子も多いため、CTLやNK細胞のHBV認識・活性化にどのように関与しているかに関する機能解析が必要となる。そこで、健常人やHBVキャリアから採取した末梢血単核球（PBMC）を用いてHBV感染細胞との反応性をin vitroにて評価する。HBV感染・非感染肝細胞の培養上清中に、検討1で抽出された分子（recombinant proteinなど）を添加したのち、PBMCと共培養し、CTL、NK細胞活性化の有無をFACSや細胞の免疫染色を用いて評価する予定である。
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| Causes of Carryover |
研究実施施設の移動があったため、実験室を新たに整備する必要があったことに加え、COVID-19などの影響で、実験機器の入手に時間を要し、実験室整備が遅れたため。
現在、実験施設の整備がほぼ完了し、リアルタイムPCRの準備を進めており、2021年度に抽出した遺伝子に関して機能解析を実施していく予定である。
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Research Products
(18 results)
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[Journal Article] Increasing incidence of non-HBV- and non-HCV-related hepatocellular carcinoma: single-institution 20-year study2021
Author(s)
Nagaoki Y, Hyogo H, Ando Y, Kosaka Y, Uchikawa S, Nishida Y, Teraoka Y, Morio K, Fujino H, Ono A, Nakahara T, Murakami E, Yamauchi M, Okamoto W, Kawaoka T, Tsuge M, Hiramatsu A, Miki D, Imamura M, Takahashi S, Chayama K, Aikata H.
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Journal Title
BMC Gastroenterology
Volume: 21
Pages: 306
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Presentation] KIF4A, a new host factor required for surface localization of NTCP, and HBV/HDV infection2021
Author(s)
Gad SA, Sugiyama M, Tsuge M, Wakae K, Fukano K, Watanabe N, Kato T, Murayama A, Li Y, Shoji I, Shimotohno K, Chayama K, Muramatsu M, Wakita T, Nozaki T, Aly HH.
Organizer
2021 International HBV Meeting
Int'l Joint Research
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