2021 Fiscal Year Research-status Report
AMPデアミナーゼ活性制御機構の解明と糖尿病性心筋症治療への応用
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21K08110
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| Research Institution | Sapporo Medical University |
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Principal Investigator |
丹野 雅也 札幌医科大学, 医学部, 准教授 (00398322)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
久野 篤史 札幌医科大学, 医学部, 准教授 (30468079)
矢野 俊之 札幌医科大学, 医学部, 講師 (40444913)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | AMPD3 / MAM / mitochondria / diabetic cardiomyopathy |
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| Outline of Annual Research Achievements |
糖尿病性心筋症は発症早期には左室拡張機能障害を呈する。我々は肥満2型糖尿病モデルラットであるOLETFの左室心筋を用い、糖尿病合併心筋において、AMP deaminase (AMPD) 活性亢進によるATPレベルの低下と酸化ストレス増加が拡張能機能障害に寄与することから、AMPD活性制御が糖尿病性心筋症の新たな治療標的になり得ることを報告した。本研究ではAMPDの細胞内局在に着目して検討を行なっている。
左室心筋各細胞分画におけるAMPDの局在をウェステンブロット法で解析したところ、主要なアイソフォームである90-kDa AMPD3はOLETFにおいて非糖尿病対照ラットであるLETOと比較して小胞体や小胞体-ミトコンドリア接触(MAM)領域においてその発現レベルが有意に上昇していた。電子顕微鏡による観察では心筋のMAM領域はOLETFにおいてLETOと比較して有意に広かった。また、H9c2細胞においてFLAG-AMPD3をトランスフェクションしたところ、対照ベクターと比較して有意にMAM領域が広くなったことから、OLETFにおけるMAM領域の拡大はAMPD3発現増加が関与する可能性が示唆された。左室後負荷を増大させた状態で採取した心筋ミトコンドリアのCa2+濃度はOLETFにおいてLETOよりも有意に高く、AMPD3を過剰発現したH9c2細胞のミトコンドリアにおいてもCa2+濃度が上昇した。さらに、H9c2細胞において過酸化水素暴露によるミトコンドリア膜電位の低下はAMPD3の過剰発現で増悪し、発現抑制で軽減した。細胞外フラックスアナライザーを用いた解析ではAMPD過剰発現によりミトコンドリア呼吸鎖複合体Iの機能異常が生じた。これらの成績からMAMに局在するAMPD3は、そのレベルが過剰になるとミトコンドリアカルシウム負荷による機能異常を惹起すると考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
肥満2型糖尿病モデルであるOLETFにおいてAMPD3の細胞内局在を解析し、糖尿病心筋での修飾を見出すことができた。さらに、小胞体-ミトコンドリア接触（MAM）領域におけるAMPD機能に関しては当初の仮説とは異なるものの、ミトコンドリCa2+負荷に寄与することを見出すことができ、研究全体としては当初の予定どおりに解析を進めることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
AMPD3がMAMの形成を促進し、MAM領域を拡大する機序については現時点では不明であるため、残りの研究期間においてさらに解析を進めたい。抗AMPD3抗体による免疫沈降物を用いてmass spectrometryで解析することにより、MAM構成蛋白との相互作用の有無を検討する。また、我々は以前に、AMPD3の発現がmiR-301bによる転写後調節により制御されることを見出し報告している。そこで、miR-301b mimicをOLETFに投与することにより、MAMの形成が抑制されトコンドリアCa2+過負荷が軽減するのか、ミトコンドリア呼吸鎖機能が改善するのか、さらにはin vivoの実験において圧負荷による拡張機能障害が改善するかを圧-容積曲線を用いて解析する。microRNA mimicの導入に関してはmirVana TM miRNA mimics and inhibitorsおよびinvivofectamine2.0試薬を用いる予定である。
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| Causes of Carryover |
COVID19蔓延によって、参加、発表予定であった国際学会、国内学会がすべてオンライン開催となり旅費がまったくかからなかったため次年度使用額が生じた。
COVID19による行動制限も世界的に緩和されており、2022年度は国際学会、国内学会とも参加、発表予定であるため、次年度使用額の一部は旅費として使用する。また、当初の予定どおりの論文投稿料や、予定している実験によって生じる費用にあてる（各種抗体、試薬、動物購入など）。
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[Journal Article] Xanthine oxidoreductase-mediated injury is amplified by upregulated AMP deaminase in type 2 diabetic rat hearts under the condition of pressure overload.2021
Author(s)
Igaki Y, Tanno M, Sato T, Kouzu H, Ogawa T, Osanami A, Yano T, Kuno A, Miki T, Nakamura T, Miura T.
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Journal Title
J Mol Cell Cardiol
Volume: 154
Pages: 21-31
DOI
Peer Reviewed
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