2021 Fiscal Year Research-status Report
Study of LINC0046 in EGFR mutation-positive lung cancer using circulating tumor cells
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21K08169
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| Research Institution | Toho University |
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Principal Investigator |
磯部 和順 東邦大学, 医学部, 准教授 (70385607)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | EMT / アポトーシス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度のLINC00460による腫瘍増大やEMTやアポトーシス耐性をするため、CRISPR Cas9を用いたLINC00460のノックアウト細胞の樹立し、間葉系細胞にvimentin, 上皮系マーカーにE-cadherinを用いて蛍光顕微鏡にてEMTを確認し、LINC00460のノックアウト細胞を用いてEGFR-TKI (gefitinib, erlotinib, afatinib, Osimertinib) のMTT asseyを行い、アポトーシス耐性のメカニズムを解明するためにカスパーゼ活性を確認をおこなった。結果、細胞株肺癌細胞株(A549, H1299, PC-9, H1975)は野生型の肺癌細胞株と比較してlncRNAの発現は有意に亢進し(p < 0.001)、EGFによるLINC00460の発現量の変化を調べたところ、EGFRが活性化された場合にも発現誘導されることが示された。また、LINC00460をノックアウトした細胞株では、野生型の細胞株に比べてgefitinibの感受性が増大することがわかった。EGFR-TKI (gefitinib, erlotinib, afatinib, Osimertinib) のMTT asseyではそれぞれのノックアウトした細胞株ではwild typeの細胞株よりviabilityの低下が認められ、LINC00460はEGFR-TKI耐性に関与していることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和3年度の目標であるLINC00460による腫瘍増大やEMTやアポトーシス耐性の解明について、概ね順調に進行している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度は、EGFR遺伝子変異陽性および陰性の原発性肺癌の手術検体をそれぞれ50例を選択し、腫瘍を含む部分と含まない部分のブロックを作成し、腫瘍を含む部分と含まない部分のブロックをRNA用検体（10μm、3〜4片/1 tube）のLINC00460のプライマーを用いて、RNA用検体をPCR法でLINC00460を同定し、半定量化し、抽出したDNAからはEGFR感受性変異、T790MはCobas EGFR mutation test ver.2で、C797SはDirect Sequence法で検出する。
また、全血10mlより血球成分のみを抽出し、CTC濃縮器（ClearCell ® FX system）をラベルフリーのCTCを採取し、QIAamp DNA Micro KitにてDNAを、RNeasy Micro KitにてLINC00460を抽出し、抽出したcfRNAからLINC00460, BIM、PD-L1, HER2, MET, VEGFRA, PUMA, EGFR, BIM-EL,L,Sを Real-time PCR法を用いて発現を検証する相対定量を実施し検討を行なっていく予定である。
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| Causes of Carryover |
研究は順調に進み、消耗品の出費が予想より低かった為に次年度使用額が生じた。次年度は試薬の購入、解析費用、学会参加・論文発表の費用に使用する予定である。
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