2022 Fiscal Year Research-status Report

Steroid resistance in cytokine and matricellular protein production of human airway smooth muscle cells

Research Project

Project/Area Number	21K08174
Research Institution	University of Fukui
Principal Investigator	石塚全福井大学, 学術研究院医学系部門, 教授 (50302477)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	門脇麻衣子福井大学, 学術研究院医学系部門(附属病院部), 医員 (20401979)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	気管支喘息 / プロトン / コバルト / ニッケル / CTGF / ＴGF-beta / OGR1
Outline of Annual Research Achievements	正常ヒト気管支平滑筋細胞（BSMC)を用いてtransforming growth factor-beta 1(TGF-b)、プロトン、金属（コバルト Co、ニッケル Ni）刺激によるconnective tissue growth factor (CTGF)産生を検討した。また、CTGF産生に対するグルココルチコイド（dexamethasone: DEX)、重症喘息治療標的のTSLP, IL-4, IL-13 の影響についても検討した。細胞外pH7.4 においてTGF-b (1 ng/mL)、Co(0.3 mM)、Ni(0,3 mM)はBSMCの十分量のCTGF産生を誘導した。プロトン刺激（細胞外pH 6.3）とTGF-b 刺激の同時刺激、金属（Co またはNi)とTGF-b の同時刺激によってCTGF産生は相加的～相乗的に増加したが、プロトン刺激と金属刺激には相加作用はなく、むしろ拮抗的に作用した。DEXはCTGF産生を増加させ、逆にIL-13/IL-4 はCTGF産生を減少させた。Gq 阻害薬YM-254890はプロトン刺激、金属刺激によるCTGF 産生を抑制したが、TGF-b 刺激には影響しなかった。一方、プロトンとTGF-b の同時刺激によるCTGF産生はYM-254890 によって強力に抑制されたが、金属（Co またはNi) とTGF-b の同時刺激によるCTGF 産生ではYM-254890 による抑制はみられなかった。プロトン、Co、Ni はいずれもプロトン感知性受容体OGR1/GPR68 のリガンドとして作用し、BSMC においてCTGFのほか、IL-6、IL-8 産生を誘導するが、TGF-b と同時に刺激した場合にプロトンとCo、Ni の作用においてGq 阻害作用の乖離が観察されたことより、金属刺激ではOGR１を介さない別の作用機序の存在が示唆される。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason BSMCにおいて、プロトン刺激、TGF-beta1(TGF-b)刺激によって誘導されるCTGF産生はdexamethasone(DEX)には抑制されず、ステロイド抵抗性であり、DEX によってCTGF が産生は逆に誘導されることは確認できた。一方、プロトンとTFG-b刺激はBSMC のCTGF産生を相加的～相乗的に誘導する。同様に金属（コバルトまたはニッケル）刺激も相加的～相乗的にCTGF産生を惹起する。一方で、プロトンと金属には相加作用がなくむしろ拮抗的であり、OGR1リガンドとして競合するためかもしれない。プロトン刺激と金属刺激によるGq の関与に相違がみられる現象が観察されたので、その点を切り口として、BSMCのCTGF産生における細胞内メカニズムを残りの研究期間で明らかにしていくことができると考え、研究は順調に進展していると判断した。
Strategy for Future Research Activity	コバルト、ニッケル刺激とプロトン刺激のOGR/GPR68 リガンドとしての作用の差がみられることに関して、コバルト、ニッケルにはOGR１、Gq とは別のシグナル伝達経路があると予想している。CTGFの産生に関わる細胞内シグナル伝達因子として、TGF-beta、Smad2/3 を介する経路、MAP キナーゼファミリーの活性化、転写因子NF-kappaB の活性化のほかに、転写因子HIF-1 の関与が予想される。TGF-beta 、コバルト、ニッケルはHIF-１を誘導することが報告されており、私たちの予備実験の結果からHIF-1alphaの転写活性阻害物質や　HIF-1alpha分解促進物質はBSMC のCTGF 産生を抑制する結果が得られている。今後、BSMC のOGR1/GPR68 を介するCTGF 産生、TGF-beta 受容体を介するCTGF 産生において、HIF-1 がどのような関与をしているのかについて、siRNA でOGR1の発現をノックダウンしたBSMCなどを用いて解析を進めていきたい。
Causes of Carryover	研究計画通りに研究は進んでおり、その成果の一部は2021 年12 月にJournal of Inflammation Research 誌に発表した。研究分担者の門脇麻衣子が2022 年度まで関連した研究テーマで科研費を取得しており、気管支平滑筋細胞の培養に関連する試薬、細胞内シグナル伝達解析のための研究試薬などを共用することができたため、次年度使用が生じた。本年度の研究で金属とプロトンは気管支平滑筋細胞のOGR1のリガンドとして共通の作用を有する一方で、CTGF 産生においてはその作用機序に相違があることを見出したので、その研究をさらに進める予定である。