気道上皮細胞による気道軟骨/平滑筋の恒常性維持機構の解明

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K08208
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 田所 友美 横浜市立大学, 医学部, 助教 (20507644)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 気道上皮幹細胞 / 上皮間葉相互作用 / 気道軟骨 / 気道平滑筋

Outline of Annual Research Achievements

哺乳類の呼吸器系は、細菌やウィルスを取り除き空気を運ぶ気道と酸素を血液中に取り込む肺胞から成る。気道の内側は気道上皮細胞に覆われており、異物を捉える粘液を分泌する杯細胞を含む分泌細胞とそれらを排出する繊毛細胞から構成され、その下に気道上皮幹細胞である基底細胞が存在する、偽重層上皮構造を有する。一方、気道の外側は軟骨と平滑筋が組み合わさり、管の強度を保つと同時に管の太さを調節可能な構造になっている。前年度に腹側背側の気道上皮幹細胞における遺伝子発現に大きな相違があることについて国際学術誌に発表を行い、気道の発生や維持機構に気道上皮幹細胞のヘテロジェネイティが果たす役割を示唆した（Tadokoro et al., Biol Open, 2021）。抽出された遺伝子を気道上皮特異的にノックアウトし、気道の形成、特に気道軟骨や気道平滑筋形成にどのような影響を与えるかについて検討を行う予定である。本年度はゲノム編集技術を使用した遺伝子改変floxマウスの系統拡大維持（理化学研究所との共同研究）、Creマウスとの掛け合わせによるコンディショナルノックアウトマウスの作製を試みた。前年度に試みた共培養系は、軟骨細胞と平滑筋細胞の培養条件が大きく異なることが明らかになったため、本年度はin vitroにおける肺の器官培養について検討を行い、気道及び肺を含めて７日程度までの器官培養が可能であることを確認した。その際に、平滑筋の収縮運動も認められ、遺伝子改変マウスを用いた呼吸器組織(気道・肺)における平滑筋分化や軟骨分化の比較検討を実施可能な基盤を構築した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

前年度に腹側背側の気道上皮幹細胞において、細胞増殖能や遺伝子発現に大きな相違があることについて国際学術誌に発表を行った（Tadokoro et al., Biol Open, 2021）。このことは、気道の発生や維持機構に気道上皮幹細胞のヘテロジェネイティが果たす役割を示唆している。腹側背側で発現の異なる遺伝子を気道上皮特異的にノックアウトし、気道の形成、特に気道軟骨や気道平滑筋形成にどのような影響を与えるかについて検討を行う。本年度はゲノム編集技術を使用した遺伝子改変floxマウスの系統拡大維持（理化学研究所との共同研究）、Creマウスとの掛け合わせによるコンディショナルノックアウトマウスの作製を試みたが、自然交配によるコンディショナルノックアウトマウスの作製に困難が生じたため、人工授精など他の方法を検討している。前年度に試みた共培養系は、軟骨細胞と平滑筋細胞の培養条件が大きく異なることが明らかになったため、本年度はin vitroにおける肺の器官培養について検討を行い、気道及び肺を含めて７日程度の器官培養が可能であることを確認した。その際に平滑筋の収縮運動も認められ、遺伝子改変マウスを用いた呼吸器組織(気道・肺)における平滑筋分化や軟骨分化の比較検討を実施可能な基盤を構築した。

Strategy for Future Research Activity

今後は、人工授精などを駆使して遺伝子改変floxマウスとKRT5-CreERT2マウス等をかけ合わせてコンディショナルノックアウトマウスの作製を実施することで、気道上皮幹細胞による気道形成・維持機構の解明を目指す。In vivo解析を裏付けるためのin vitro培養系に関しては、上記コンディショナルノックアウトマウスの肺の器官培養を用いて平滑筋や軟骨の増殖・分化に与える影響について、遺伝子発現解析や組織学的解析を実施予定である。

Causes of Carryover

本年度に遺伝子発現解析や組織解析を本格実施予定であったが、目的の遺伝子改変マウスの作製に遅延が生じており差額が生じた。
2023年度に遺伝子改変マウスを用いた遺伝子発現解析や組織解析を実施予定。