Analysis of role of YB1 in PD-L1 expression to develpe immune check point inhibitor therapy

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K08217
• Research Institution: Fujita Health University
• Principal Investigator: 水谷 泰嘉 藤田医科大学, 医学部, 助教 (10546229)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 稲田 健一 藤田医科大学, 医学部, 教授 (70246081) ; 鈴木 元 藤田医科大学, 医学部, 教授 (80236017)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: PD-L1 / YBX1 / 肺がん

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、PD-L1（Programmed death 1 ligand 1）の発現制御におけるYBX1（Y box binding protein 1）の機能を明らかにすることである。これまでに、肺がん細胞株においてYBX1がPD-L1 mRNAの安定性を低下させることを明らかにしている。本年度は、YBX1によるPD-L1 mRNAの安定性低下のメカニズムを明らかにするため、PD-L1 mRNAのintron retentionにおけるYBX1の関与を検証した。YBX1をノックダウンした肺がん細胞株からRNAを抽出して、cDNAを合成した。PD-L1遺伝子のexon1からexon7にかけて、各exon-intron junctionをまたぐように設計した6セットのprimerを用いて、このcDNAを鋳型としてqPCRを行った。⊿⊿Ct法により、各primer setにより検出された発現量をYBX1ノックダウン細胞とコントロール細胞で比較した。その結果、いずれのprimer setでもYBX1ノックダウンによりintron領域を含んだRNA発現量が約2～4倍増加した。これは、YBX1ノックダウンがintron retentionを助長することを示唆している。これらの結果から、YBXによるPD-L1 mRNA不安定化には、intron retentionとは異なる機構が作用していると考えられる。さらに、PD-L1 mRNAの3’-UTRを介したmRNA安定性におけるYBXの寄与を検証するため、3’-UTRをクローニングしてYBX1ノックダウン下でluciferase assayを行った。しかし現在のところ、YBX1がPD-L1 mRNAの3’-UTRを介してmRNAを不安定化することを示す結果は得られていない。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

YBX1のintron retentionへの影響はYBX1ノックダウン細胞を対象としたRT-qPCRにより否定された。PD-L1 mRNA 3'-UTRを介したYBX1の影響を検証するために、PD-L1 mRNAの3'-UTRをluciferase assay用のベクターへクローニングしてluciferase assayに用いた。しかし、YBX1ノックダウンによりコントロールベクターでもluciferase活性が変化するため、3'-UTRとYBX1ノックダウンとの関連を検証できていない。そのため、進捗がやや遅れている。

Strategy for Future Research Activity

引き続き、PD-L1 mRNAの3’-UTRを介したYBX1の影響を検証する予定である。3’ race法等を用いて、PD-L1 mRNAの3’-UTRについて、YBX1による構造変化を検証する。また、ヒト肺がん組織において、PD-L1とYBX1の発現パターンを検証する。肺がんの病理組織標本を用いて、PD-L1とYBX1の免疫染色を行って、両分子の発現パターンを比較する。in vitroで観察されるように、PD-L1とYBX1の発現が逆相関するかどうかを調べる予定である。