2022 Fiscal Year Research-status Report
微小変化型ネフローゼ症候群の発症にノンコーディング RNAは関与するか？
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21K08247
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
高木 陽子 群馬大学, 医学部附属病院, 医員 (70813517)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小林 靖子 群馬大学, 医学部附属病院, 講師 (60451720)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 微小変化型ネフローゼ症候群 / ノンコーディングRNA / nc886 / ポドサイト |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度までに、健常ヒトポドサイト細胞株におけるnc886遺伝子領域のDNAメチル化率の解析と、健常ヒトポドサイト細胞株における感染モデルとNSモデルでの nc886の発現解析を行った。
今年度は、nc886が蛋白尿発現するポドサイト機能にどのように関与しているか検討するために、Poly(I:C)を用いた感染モデル、患者検体を用いたNSモデル、nc886ノックダウンポドサイトにおいて、蛋白尿発現時のポドサイト形態の特徴を示すかについての検討を開始した。感染モデルにおいて、ファロイジンの蛍光染色を用い、アクチンストレスファイバーの変化を検討したところ、Poly(I:C)刺激1時間後に、アクチン重合の減少を認めた。
次に、nc886ノックダウンポドサイトにおいて同様の検討を行うために、siRNAを用いてnc886ノックダウンポドサイト細胞株の作成を試みた。siRNA導入後にRt-PCR法を用いてnc886発現を確認したが、未分化増殖期のポドサイト細胞株では有意なnc886の発現低下が得られなかった。そこで、HEK293T細胞におけるnc886ノックダウンを試みたところ、nc886発現低下を得られた。また、nc886が機能的にノックダウンされているか確認するために、nc886発限低下によりPKR活性が進むことから、Western blotting法を用いて、PKR活性を測定した。siRNAを導入したHEK293T細胞では、negative controlと比較してPKRが活性化していた。現在、再現性があるか検討中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ヒト健常ポドサイト細胞株でnc886ノックダウンがうまくゆかなかったため時間を要した。
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| Strategy for Future Research Activity |
nc886ノックダウンHEK293T細胞の作成が確立されたら、ノックダウン細胞におけるアクチンストレスファイバーの変化を検討する。その時点で、これまでのデータと併せて論文作成に着手する。
一方で、HEK293T細胞におけるアクチンストレスファイバーの変化が確認されたら、細胞骨格リモデリングに関与するシグナル伝達である、pVASPやRho GTPaseの変化を検討する。同じく、ポドサイト細胞株でもCRISPR-Cas9を用いたnc886ノックアウトポドサイトの作成を行い、同様の検討を進める。
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| Causes of Carryover |
nc886ノックダウンポドサイトの作成に難渋し、実験が予定より遅れたために、予定額との差額が生じた。細胞を変えたことでノックダウン細胞が作成できたので、予定の実験を進めていく。
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