微小変化型ネフローゼ症候群の発症にノンコーディング RNAは関与するか？

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K08247
• Research Institution: Gunma University
• Principal Investigator: 高木 陽子 群馬大学, 医学部附属病院, 医員 (70813517)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小林 靖子 群馬大学, 医学部附属病院, 講師 (60451720)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 微小変化型ネフローゼ症候群 / ノンコーディングRNA / nc886 / ポドサイト

Outline of Annual Research Achievements

令和4年度までに、健常ヒトポドサイト細胞株におけるnc886遺伝子領域のDNAメチル化解析と、健常ヒトポドサイト細胞株における感染モデルとNSモデルでのnc886の発現解析、健常ヒトポドサイト細胞株における感染モデルのアクチンストレスファイバーの形態変化についての検討を行った。
令和5年度は、ノンコーディングRNA886(nc886)のポドサイト機能異常に対する意義を明らかにするため、nc886ノックダウン細胞の作成を試みた。siRNAを用いて健常ヒトポドサイト細胞株とヒト胎児腎由来の細胞株であるHEK293T細胞で作成した。ノックダウンされているかの確認は、①rt-PCR法を用いてnc886発現を測定、②機能的ノックダウンとして、Western Blotting法を用いてPKR活性測定を行った。しかし、データにばらつきを認め再現性に乏しく、安定したノックダウン細胞の作成が困難であった。
今年度は、アンチセンスオリゴやCRISPR/Cas9システムを用いて、ヒト子宮頸がん由来の細胞株であるHeLa細胞にて、nc886ノックダウン/ノックアウト細胞を作成中である。RT-PCR法にてnc886のノックダウンが確認できたら、Western Blotting法にてPKR活性の測定を行い、機能的にもnc886がノックダウンされていることを確認する。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

nc886ノックダウン細胞の作成に時間を要しているため。

Strategy for Future Research Activity

Nc886ノックダウン/ノックアウトHeLa細胞の作成が確立されたら、免疫染色にてアクチンストレスファイバーの変化を検討する。ここまでの検討が終了したら、これまでのデータと併せて論文化する。
一方で、HeLa細胞におけるアクチンストレスファイバーの変化が確認されたら、細胞骨格リモデリングに関与するシグナル伝達である、pVASPやRho GTPase、Rac1の変化を検討する。さらに、健常ヒトポドサイト細胞株でも同様の検討を進める。

Causes of Carryover

nc886ノックダウン細胞の作成に難渋し、実験が予定よりも遅れたために、予定額との差額が生じた。ノックダウンの手法を変えることで、ノックダウン細胞が作成できように実験に取り組んでいく。