2022 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of intra-ciliary signals that control the onset of nephronophthisis
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21K08259
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
中島 由郎 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (30455430)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | ネフロン癆 / 一次線毛 / ANKS6 / リン酸化 / 嚢胞腎 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞内小器官である一次線毛の欠失や構造・機能異常は腎臓のみならず、多くの組織・器官に異常をもたらす。ネフロン癆の責任遺伝子産物（NPHP）は、主に一次線毛に局在する。最近、研究代表者はNPHPの一種であるANKS６（NPHP16） のリン酸化がネフロン癆モデルマウスの腎臓で阻害されていることを報告した。ネフロン癆発症機序の解明を目的としてANKS６ のリン酸化の意義を明らかにするために、まずリン酸化されているANKS６のアミノ酸残基を同定することを試みた。 樹立済みのマウス近位尿細管上由来の培養細胞（Dai1細胞）に対して、CRISPR/Cas9 システムを利用してANKS６遺伝子のN末端にPAタグを読み枠が合うようにデザインし、ゲノム編集を行なった。作製したPAタグN末端付加ANKS６ 安定発現細胞株から、タグに対する抗体で免疫沈降を行い、溶出液をSDS-PAGEで分離し、ゲルを銀染色した。その結果、分子量からANKS６と推測されるバンドが銀線色によって検出されたため、その部位のゲルを切り出し、理化学研究所に質量分析を依頼した。質量分析の結果、ANKS６の７３２番目のセリンをリン酸化部位として同定した。現在、ANKS６の７３２番目のセリンをアラニンに置換してリン酸化ができないアミノ酸変異（S７３２A）を導入したES細胞の作製を行なっており、この変異体ES細胞を用いてキメラマウスの作製を予定している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
二年目の研究計画は一年目に明らかにしたANKS6のリン酸化部位（S７３２）の生物学的意義を知るためにリン酸化できないアミノ酸変異（S７３２A）を導入して個体レベルで解析を行うことである。ANKS６遺伝子への変異の導入はCRISPR/Cas9 システムを利用して行う。まずES細胞にS７３２Aのアミノ酸変異を導入し、そのANKS６変異体ES細胞とマウス胚からキメラマウスを作製する。現在、CRISPR/Cas9 システムによるES細胞へのアミノ酸変異導入を試みている段階である。具体的には、CRISPR/Cas9ベクターであるpX459に20mer標的配列に基づくオリゴヌクレオチド（sgRNA合成用）を挿入し、標的DNA切断プラスミドを構築した。次にS７３２A変異を導入するssDNAを合成し、構築した標的DNA切断プラスミドと一緒にES細胞にリポフェクションで遺伝子導入した。薬剤セレクションの結果、ES細胞をピックアップし、そのゲノム配列をDNA配列解析を行った。結果としてES細胞のゲノムDNAに対してCRISPR/Cas9による切断は確認できているが、S７３２A変異の導入に成功したES細胞は得られていない。結論としてANKS6遺伝子の７３２Aのアミノ酸変異を導入したES細胞の樹立に成功していないために研究計画が遅延している。
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| Strategy for Future Research Activity |
二年目の研究計画は、一年目に明らかにしたANKS6のリン酸化部位（S７３２）の生物学的意義を知るためにS７３２がリン酸化できないアミノ酸変異（S７３２A）を導入して個体レベルで解析を行うことである。現在、キメラマウスを作製するためにCRISPR/Cas9 システムによるES細胞へのアミノ酸変異導入を試みている段階であるが、S７３２Aのアミノ酸変異を導入したES細胞の樹立に成功していない。今後はES細胞への標的DNA切断プラスミドとssODNの導入効率を向上させるために次の方法を試みる。まず細胞に導入するプラスミドとssODNの量を最適化する。遺伝子導入方法として現在採用しているリポフェクションの代わりにエレクトロポレーションを試す。以上の改善点によって変異型ANKS6（S７３２A）を持ったES細胞を樹立させたい。
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| Causes of Carryover |
年度内に受託解析を予定したために、助成金を前倒し請求したが、結果的に受託解析の準備が整わず、受託解析を次年度に依頼することになった。よって次年度使用額は翌年度分として請求した助成金と合わせて、前年度に行えなかった受託解析など計画通りに使用する。
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