2021 Fiscal Year Research-status Report
特異的抗体を用いた新規標的タンパク質分解誘導薬によるメラノーマ治療薬の開発に挑む
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21K08297
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| Research Institution | Gifu University |
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Principal Investigator |
矢澤 重信 岐阜大学, 大学院医学系研究科, 招へい教員 (30392153)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大沢 匡毅 岐阜大学, 大学院医学系研究科, 教授 (10344029)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 標的タンパク質分解誘導 / E3ユビキチンリガーゼ / ALFAタグ / ナノボディ / FACS解析 / メラノーマ / 標的分子探索 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、ユビキチン-プロテアソーム系を利用したプロテインノックダウン法による標的タンパク質分解誘導薬という新しいタイプの創薬研究が注目を集めている。本研究では標的分子に結合する低分子化合物に代わって、特異的な低分子化抗体（ナノボディ）を用いたプロテインノックダウンによる新規の標的タンパク質分解誘導薬の開発を目的とし、ナノボディ-E3ユビキチンリガーゼ融合タンパク質によるプロテインノックダウンの実証、ならびに各種E3リガーゼにおける標的タンパク質分解の有効性の比較検証による最適化を行う。これに基づき、効果的な治療法の確立が急務となっている難治癌の一つである悪性黒色腫（メラノーマ）を対象とした治療薬の開発を目指し、メラノーマにおける標的タンパク質の探索とそのプロテインノックダウンの実証によるメラノーマ治療薬の開発に挑戦する。
ヒトは600種類以上のE3リガーゼを持つと推定されており、比較検証用として11種のユビキチン化ドメインとナノボディの融合タンパク質発現コンストラクトを用意した。蛍光レポーターを発現する培養細胞株にこれら検証用コンストラクトを強制発現し、蛍光強度の減少を指標としてプロテインノックダウンの有効性の検証を進めた。またメラノーマにおけるプロテインノックダウンの標的分子として、最近のオミクス解析などを主に文献的に、または公開データベース等の解析に基づいて調査し、実証モデルとなりうる分子の探索を進めた。一方でこの標的分子に対する特異的ナノボディライブラリのスクリーニングのための準備を進めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
検証実験を進めるにあたっていくつかの計画外の準備や試験が必要となった。当初、10種のE3リガーゼについて比較検証を進める計画であったが、最新の情報を踏まえ11種12コンストラクトへと増数することとし、同様の発現コンストラクトを追加作製した。さらに事前のチェックを経て、コンストラクトの共通部分の一部に修正が必要になったため、改めて全てのコンストラクトを再調整しなければならなくなった。また強制発現したALFAタグ-ナノボディの結合親和性（特異性）の検証が必要となったため、新たに発現ベクターを作製し、一過的発現系における試験を追加した。結果的には問題なく当初の計画通りにナノボディが結合していることが裏付けられ、確実な検証が行えることになったと言える。実際に検証用のレポーター発現ホストHEK293T細胞に強制発現を行なったところレポーター蛍光の減少が観察された。ノックダウン効率をFACSよりも簡便に比較検証するためにデジタルイメージングによる定量解析を試行したが、本件で想定したような解析が困難であったため、本来の計画通りFACSにより定量解析を行うこととした。
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| Strategy for Future Research Activity |
比較検証に必要な発現ベクターやホスト細胞の準備が整ったため、比較検証実験に取りかかっている。計画通りにフローサイトメーターを用いた定量的な解析によって、ノックダウン効率を算出する。比較対象コンストラクトを増加したことにより検証実験数の増加も見込まれるが、同時並行的な解析数の増加となるだけで作業自体に大きな影響はないと見込まれる。予備実験では経時的なレポーター蛍光の強度変化が認められており、そもそも標的タンパク質の分解は迅速に行われるとの報告があることから、FACS解析を実施するタイミングには注意を払う必要がある。メラノーマにおける標的分子の探索については継続的に情報の収集やデータ等の解析が必要であるが、候補分子に対するナノボディを取得するためのライブラリスクリーニングを行わなければならない。情報の収集と並行してライブラリスクリーニングの準備を整え、候補標的分子を抽出次第、順次ナノボディのスクリーニングを進め、メラノーマB16細胞での検証実験に必要な発現コンストラクトの調整を進める。
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