2021 Fiscal Year Research-status Report

全身性強皮症におけるTLR7およびTLR9の役割についての解析

Research Project

Project/Area Number	21K08320
Research Institution	Kanazawa University
Principal Investigator	小林忠弘金沢大学, 医学系, 協力研究員 (20746383)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	全身性強皮症 / Toll-like receptor 7 / Toll-like receptor 9 / ブレオマイシン誘発強皮症モデルマウス
Outline of Annual Research Achievements	全身性強皮症は皮膚および内臓諸臓器の障害と線維化を特徴とする自己免疫疾患であり、根本的な治療法は確立されていない。その病態として免疫細胞・血管内皮細胞・線維芽細胞の相互作用が考えられているが、近年の研究により自然免疫に重要な役割を有するToll-like receptor (TLR)も関与していることが示されている。この研究では、様々な細胞内のエンドソーム膜に発現しており炎症性サイトカインの産生に関与しているTLR7およびTLR9がどのように全身性強皮症の病態に関与しているかを調べるため、ブレオマイシン誘発強皮症モデルを利用して実験を行った。具体的には、ブレオマイシン誘発強皮症モデルマウスにおける皮膚硬化および肺線維化を評価した。8-10週齢の野生型マウス（Balb/c）、Toll-like receptor (TLR)7欠損マウス、TLR9欠損マウスの背部皮下にそれぞれブレオマイシン溶液（1mg/mL）300μLを4週間、隔日で皮下注射した（コントロールとしてはPBSを使用）。その後にそれぞれのマウスの皮膚組織および肺組織を採取し、Hematoxylin-Eosin染色、Masson Trichrome染色にて線維化の程度を評価した。結果として、皮膚における線維化の評価ではブレオマイシン投与群において野生型マウスとTLR7欠損マウスの間には有意差はなかったが、TLR9欠損マウスでは野生型マウスおよびTLR7欠損マウスに比べ有意に線維化が軽度であった。肺における線維化の評価でも、ブレオマイシン投与群において野生型マウスとTLR7欠損マウスの間には有意差はなかったが、TLR9欠損マウスでは野生型マウスおよびTLR7欠損マウスに比べ有意に線維化が軽度であった。このように、皮膚および肺組織のいずれにおいてもTLR9欠損マウスではブレオマイシン投与による線維化が軽度であった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason ブレオマイシン誘発強皮症モデルにおける野生型マウス・TLR7欠損マウス・TLR9欠損マウスの皮膚および肺の線維化の評価は予定通り遂行することができた。この実験結果から、TLR9欠損マウスは他のマウスに比べて皮膚および肺の線維化が軽減されるという知見を得ることができた。一方、マウスの成育が予定より遅れたためブレオマイシン誘発強皮症モデルマウス（野生型マウス、TLR7欠損マウス、T LR9欠損マウス）の皮膚および肺に浸潤した炎症細胞（T細胞、制御性T細胞、B細胞、マクロファージ）や組織局所におけるサイトカイン（IL-6）の免疫組織化学的な評価は次年度に行うこととなり、計画の達成度はやや遅れていると自己評価した。
Strategy for Future Research Activity	令和3年度に行うことのできなかったブレオマイシン誘発強皮症モデルマウスの皮膚および肺における免疫組織化学的な評価を行う予定である。また、それぞれのブレオマイシン誘発強皮症モデルマウスの脾臓におけるFoxP3+制御性T細胞、IL-6+B細胞、IL-10+B細胞、CD11ｂ+F4/80+マクロファージについてもフローサイトメトリーにて解析する予定である。
Causes of Carryover	令和3年度はマウスの成育が予定より遅れたためブレオマイシン誘発強皮症モデルマウス（野生型マウス、TLR7欠損マウス、T LR9欠損マウス）の皮膚および肺に浸潤した炎症細胞（T細胞、制御性T細胞、B細胞、マクロファージ）や組織局所におけるサイトカイン（IL-6）の免疫組織化学的な評価は行わなかった。この結果、免疫組織化学染色に使用する試薬を購入しなかったために次年度使用額が生じた。今後の使用計画として、前述した免疫組織化学染色のための試薬や、ブレオマイシン誘発強皮症モデルマウスの脾臓におけるFoxP3+制御性T細胞、IL-6+B細胞、IL-10+B細胞、CD11ｂ+F4/80+マクロファージのフローサイトメトリー解析のための試薬に充てる予定である。