2022 Fiscal Year Research-status Report

DCML欠損症発症に関与するGATA2による造血幹前駆細胞の分化運命制御

Research Project

Project/Area Number	21K08364
Research Institution	Tohoku University
Principal Investigator	長谷川敦史東北大学, 東北メディカル・メガバンク機構, 助教 (80747460)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	GATA2 / DCML欠損症
Outline of Annual Research Achievements	GATA2は造血幹細胞の産生と機能維持に必須の転写因子である。特定系列の免疫細胞産生異常を示すDCML欠損症より、GATA2遺伝子変異が多数見つかっており、これまで不明な点が多かった血球運命決定・分化制御におけるGATA2の役割が強く示唆されている。本研究ではDCML欠損症モデルマウス（Gata2R398W/+マウス）を用い、GATA2変異により惹起される、造血幹前駆細胞における分化運命の偏向と、責任遺伝子の転写制御異常の解析を目的とした。疾患患者およびモデルマウスにおいて減少する血球系列の前駆細胞の中で、GATA2の発現が認められたリンパ球・骨髄球共通前駆細胞（LMPPおよびLP）を分取し、RNA-Seq解析により遺伝子発現異常の網羅的解析を行なった。Gata2R398W/+マウスのLMPPでは免疫細胞分化・免疫刺激応答に関わる遺伝子の発現異常が顕著であり、将来の分化運命決定および成熟過程に影響を与える細胞機能欠損が示唆された。さらにマウスBリンパ球系前駆細胞由来のBa/F3細胞株を用いたRNA-Seq解析より、GATA2変異体発現細胞では、GATA2発現に伴う増殖抑制および増殖制御遺伝子の発現抑制が起こらないことがわかった。GATA2により誘導される増殖から分化へのフェイズシフトが、変異体では起こらず増殖能を有する未分化状態を維持し続けている可能性が示唆された。以上の複数の実験系に基づいた解析結果より、これまで詳細な報告がなかったリンパ球系前駆細胞において、GATA2R398W変異に起因する遺伝子発現プロファイル変化および細胞機能異常の解明につながる成果が得られた。また本成果は、今後の分化運命偏向解析において、解析対象としてLMPPを含む分画を用いることが、良好な結果を得るための指針となることを示している。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 2021年度までに、DCML欠損症モデルマウスにおけるリンパ球・骨髄球の共通前駆細胞（Lymphoid-primed multipotent progenitor : LMPPおよびLymphoid progenitor : LP）でのGATA2発現解析と次世代シークエンサーを用いた網羅的RNA-Seq解析を行い、同分画における免疫細胞分化異常を示唆するトランスクリプトーム環境が明らかとなった。この結果により、同分画を今後の分化運命偏向解析に用いる標的分画としたが、実験計画検討中に同分画を用いる妥当性をより詳細に検討する必要が生じた。そこで、マウスBリンパ球系前駆細胞由来のBa/F3細胞株を用いたRNA-Seq解析を追加実施し、リンパ球系前駆細胞の中でも、よりBリンパ球に近い性質を持つ細胞におけるGATA2変異の影響を検証した。 GATA2変異体の誘導的発現株では、野生型GATA2の誘導的発現による増殖抑制および増殖制御に関わる遺伝子の発現低下が認められなかった。このことから、GATA2により誘導される増殖から分化へのフェイズシフトが、変異体では起こらず増殖を維持し続けていることが示唆された。また細胞内シグナル伝達に関わる遺伝子の発現低下が認められ、マウス骨髄におけるリンパ球系前駆細胞での表現系を一部再現する結果が得られた。遺伝子発現解析から得られた上記の結果について、引き続き解析を追加し、標的分画選定の妥当性を実験的に検証していく必要がある。
Strategy for Future Research Activity	複数のリンパ球系前駆細胞において認められた、GATA2変異体発現による細胞内シグナル伝達関連遺伝子の発現変化について、細胞機能に与える影響を解析する。特に細胞増殖能に着目し、シグナル伝達阻害剤処理を組み合わせて検証する。さらに、骨髄造血幹前駆細胞の分化運命がGATA2変異によりどのように偏向されるかを解析する。Gata2R398W/+マウスおよび対照群として野生型マウスの骨髄より、これまでの解析で分化制御関連遺伝子の顕著な発現変化が認められたLMPPと、赤血球や顆粒球系列への分化傾向を持つ前駆細胞、および造血幹細胞が含まれるLSK分画（Lineageマーカー陰性、ckit陽性、Sca1陽性分画）を単離し、Single-Cell RNA-Seqによる網羅的遺伝子発現解析を行う。個々の細胞における遺伝子発現パターンの差異と、各血球系列を特徴づけるマーカー遺伝子の発現状況から、造血幹前駆細胞集団を分化運命が異なる複数の副集団に細分化する。Gata2R398W/+マウスと野生型マウス間での副集団分布の偏向を情報学的に検出し、割合が変化した副集団の分化運命と、特徴的な発現異常を示す遺伝子を同定する。また遺伝子発現量の連続性に基づく擬似時間解析より、分化の進行過程での当該副集団の位置づけを明らかにし、当該副集団に変異GATA2の作用点があることを実証する。
Causes of Carryover	当該年度中の実験に使用する物品について、研究開始時点で用意していたものと新規購入品とを合わせることで十分な量を確保することができた。また研究の進捗具合と試薬等の使用期限を考慮すると、大容量品やストックを購入することができなかったため、繰越が発生した。次年度使用額分の使途として、細胞内シグナル解析やフローサイトメトリー解析に用いる試薬、抗体、培地類の購入費用とする。Single-Cell RNA-Seq解析・データ処理に関わる試薬物品類の購入費用とする。所属機関の共用機器使用料金の支払い費用とする。