2021 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of mitochondrial iron accumulation mechanism on sideroblastic anemia model cells
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21K08375
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| Research Institution | Iwate Medical University |
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Principal Investigator |
金子 桐子 岩手医科大学, 医学部, 講師 (10545784)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
古山 和道 岩手医科大学, 医学部, 教授 (80280874)
鈴木 亘 岩手医科大学, 医学部, 助教 (90610395)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | ヘム合成 / 鉄代謝 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究はミトコンドリアにおける鉄蓄積機構の解明を目的に、今年度は以下の項目について検討を行なった。
1. フェロケラターゼ(以下FECH)を中心とした複合体解析予備実験: 本研究は鉄がミトコンドリアに蓄積する遺伝性鉄芽球性貧血(以下CSA)では正常赤芽球とFECHを中心とした複合体構成タンパク質が異なることを作業仮説とした。そこで複合体を構成するタンパク質の同定検索を質量分析を用いて行う目的で，まず抗FECH抗体を用いた免疫沈降を行うための条件検討を行なった。大まかな条件の構築には赤芽球系培養細胞K562を，確認のためにHUDEP-2細胞(野生型)およびHA2low1細胞(鉄芽球性貧血モデル細胞，変異型)を用いたが，いずれも再現性を得ることが困難であり，方策改善の必要性が考えられた。
2. FECHの発現量および活性の検討: CSAにおけるFECH発現および活性について野生型細胞とCSAモデル細胞間で差異があるか検討を行なった。その結果，FECHタンパク質の発現は野生型と変異細胞間に有意な変化はなかった。一方，活性の測定は条件の検討を行ない，測定系の構築を進めた。
3. CSAモデル細胞樹立:CSAはALAS2以外にも複数の原因遺伝子が報告されており，原因遺伝子による鉄蓄積機構の差異についても検討する目的でSLC25A38および GLRX5遺伝子にそれぞれ変異を導入した細胞株の作製を行なっている。今年度はSLC25A38に変異を持ち，タンパク質発現が低下，分化誘導によってミトコンドリ アに鉄が蓄積する細胞株の作成に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
予定では2021年度内に質量分析に着手する予定であったが，抗FECH抗体を用いた免疫沈降の条件検討が難航したため。現在，代替手段として標識タンパク質を付加したFECHの強制発現による免疫沈降への移行を準備中である。実験計画期間は余裕を持たせて計画しており，また研究協力者は標識タンパク質を用いたプルダウンアッセイに習熟しているので課題の遂行に問題はないと考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
・複合体構成因子の検索同定は標識を付加したFECHを用いて引き続き行う。当初の計画では，予想される複合体に含まれる異なる因子に対する特異抗体を用いる代替手段を挙げていたが，FECHを中心とした複合体に焦点を絞るため，FECHに標識を付加させる方法へ切り替える。
・CSAにおける細胞死の誘導状態についての検討に着手する。ALAS2変異細胞だけでなく，2021年度に樹立したSLC25A38変異細胞も本検討に加える予定である。
・FECH活性測定検討を引き続き行う。
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| Causes of Carryover |
調達方法の工夫により、当初計画より経費の使用が節約できたことにより生じた未使用額である。 次年度は物品費として消耗品の購入に充てる計画である。
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Research Products
(1 results)
