Analysis of mitochondrial iron accumulation mechanism on sideroblastic anemia model cells

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K08375
• Research Institution: Iwate Medical University
• Principal Investigator: 金子 桐子 岩手医科大学, 医学部, 講師 (10545784)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 古山 和道 岩手医科大学, 医学部, 教授 (80280874) ; 鈴木 亘 岩手医科大学, 医学部, 助教 (90610395)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: ヘム合成 / 鉄代謝

Outline of Annual Research Achievements

1. 培養条件の再検討：本研究に用いているHUDEP細胞は樹立の報告にも記載されているが，分化誘導日数が長くなるほど細胞生存率が低下する。鉄の蓄積が顕微鏡下で検出できる条件では細胞生存率は20%前後であり，分化誘導による細胞生存率の低下はこれまでも懸念であった。近年，我々と異なる培養条件を用いているいくつかの報告があることから，それらを参考に分化条件の検討を行なった。その結果，細胞生存率およびRNA qualityが大きく改善され，生存率はHUDEP2では20%前後から60%程度へ上昇した。分化条件の変更に伴い，これまでに行なったタンパク質およびmRNA発現について再検討を行なったところ，これまで検討を行なったいくつかの因子mRNA発現について分化誘導による野生型と変異細胞株における差異を見出した。引き続き確認実験を行っている。また，2,3についても条件変更後に行った研究実績である。
2. ALAS2変異細胞におけるferroptosisの検討：ferroptosisのマーカーであるGPX4タンパク質およびGPX, PGTS2 mRNAの発現についてそれぞれ検討を行なった。その結果，GPX4の発現は分化誘導前後にかかわらず野生型と変異細胞株では変化がなかった。一方，PTGS2 mRNA発現は分化誘導が進むと変異細胞のみにおいてその発現に変化が見られた。GPX4はこれまでに赤芽球の脱核に関与する報告があることから，発現が相殺されて変化が見えづらい可能性も考えられる。
3. ALAS2変異細胞における網羅的解析：鉄蓄積機構の解明を目的に，ALAS2変異細胞と野生型細胞をについて分化誘導条件下で発現変化の網羅的解析を質量分析を用いて行う予定であったが，予算内でRNA-seq解析が行え，さらに学内の専門家の協力を得られる機会を得たため解析手法をRNA-seqに変更した。本検討には昨年樹立したSLC25A38変異細胞も加えており，遺伝性鉄芽球性貧血の異なる原因遺伝子についても比較検討を行なった。現在，結果を解析中である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

分化誘導条件の再検討および変更に伴い，いくつかの実験を再検討することとなったため。また，RNA-seqに用いるサンプル採取に予想より時間を要したことが挙げられる。
しかしながら，再実験はすでに実験条件が決定しているため2022年度中に大部分は終えている。またRNA-seqもこの報告書を作成している現在解析を行なっている最中であることから，2023年度内に予定している実験を終えることは可能である。

Strategy for Future Research Activity

・CSAにおけるferroptosisの検討はSLC25A38変異細胞も加えて他のマーカーやferroptosis阻害剤の効果についての検討を予定しており準備中である。
・質量分析を用いた網羅的解析からRNA-seqに変更した実験について解析結果を元に，鉄蓄積に関与する候補因子について解析を行う予定である。

Causes of Carryover

繰り越された次年度使用額は，外部施設へ委託したRNA-seq解析費用である。納期が確約できなかったため2022年度中の支払いが生じる可能性を考慮し確保していたが，決済が次年度となったために繰り越したため。
本報告書を作成時点で納品，請求に対する手続きは済んでおり，2022年度の予定通りに使用される。