2021 Fiscal Year Research-status Report

形質転換時の代謝リプログラミングにおけるC/EBPβの機能解明と治療戦略の開発

Research Project

Project/Area Number	21K08379
Research Institution	Tokyo University of Pharmacy and Life Science
Principal Investigator	横田明日美東京薬科大学, 生命科学部, 助教 (00571556)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	平位秀世東京薬科大学, 生命科学部, 教授 (50315933)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	転写因子 / 代謝 / 腫瘍 / 白血病
Outline of Annual Research Achievements	腫瘍形成を誘導する細胞増殖性シグナルの活性化は、RAS等がん原性の遺伝子異常によってもたらされる。形質転換における細胞増殖の異常な亢進には、増殖の支持に十分な細胞構成成分や核酸を供給するために、代謝リプログラミングが起こることが重要である。先行研究において我々は、BCR-ABL導入・造血幹・前駆細胞（HSPCs）において脂肪細胞のマスター転写因子C/EBPβが脂質代謝関連分子の発現を正に制御していることを見出している。本研究では、造血器腫瘍で認められる細胞増殖性シグナル活性化の例として、BCR-ABL、NRAS変異、FLT3変異誘導性の白血病モデルを用いて、それらシグナルの下流分子として、脂質代謝制御を担うと同時に細胞の増殖・分化の均衡に重要な転写因子C/EBPβに着目し、検討を行なっている。 2021年度は、白血病モデルの構築のための条件検討を行なった。BCR-ABL誘導性白血病モデルについては、BCR-ABL融合遺伝子をレトロウイルスを用いて導入したマウス骨髄造血幹・前駆細胞を、放射線照射処置したレシピエントマウスへ移植することで作製した。また、Nras-G12D変異誘導性白血病モデルについては、国内研究者から分与いただいたNras-G12DノックインマウスとVav1-iCreマウスを交配し、血液細胞特異的にNras変異が発現するマウスモデルを構築した。Flt3変異誘導性白血病モデルについては、Flt3-ITD（Internal tandem duplication）変異ノックインマウスを国外研究者から分与いただき、現在モデル構築中である。これまでのマウスの血液ならびに病態解析から、BCR-ABLとNras-G12Dモデルについては、致死的白血病発症や特徴的白血球分画の増加を確認した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason モデルマウスの構築に、当初の計画よりも遅れが生じている。これまで研究を行なっていた動物施設と異なる飼育環境、放射線照射装置の変更（線源のγ線からX線への変更）から、BCR-ABL導入モデルマウスにおいて骨髄移植の条件設定に時間を要した。また、当初の計画ではNras-G12DとFlt3-ITD変異について、BCR-ABLと同様にレトロウイルスを用いて骨髄移植を行う実験系でのモデルマウス構築を予定していたが、骨髄移植の条件設定や発症が見られないことから、両者ともノックインマウスを用いたモデルマウス構築に変更を行なった。国内外の研究者から得られた凍結精子・雄マウスを用いた人工授精により目的マウスを得て、申請者の研究機関の動物施設に導入されたため、時間を要した。しかしながら、結果的には、両者遺伝子変異ともに、内在性のプロモーターによって発現が制御されるため、レトロウイルス強制発現系と比較して、実際の症例により近いモデルとなると考える。
Strategy for Future Research Activity	本研究で用いる白血病モデルマウスは揃ったので、それぞれにおいてC/EBPβ遺伝子が野生型のまま維持されているものとノックアウトされているものとを交配によって作製する。得られたマウスの末梢血、骨髄細胞、脾臓細胞をフローサイトメトリーにて解析し、C/EBPβがそれぞれの白血病モデルの病態にどのような影響を与えるかを調べる。また、細胞ソーティングによって骨髄細胞から造血幹・前駆細胞を含むc-Kit陽性細胞を単離し、代謝関連遺伝子の発現、中でもC/EBPβの標的遺伝子として知られるCpt1aなどの脂質代謝関連酵素を中心に調べる。また、単離した骨髄c-Kit陽性細胞を用いて代謝解析を行い、C/EBPβによる代謝経路の制御が白血病の発症や進展に与える影響について調べるため、検討を行なっていく。
Causes of Carryover	2021年度に予算を計上していたフローサイトメトリー用抗体、プラスチック製消耗品、細胞培養用サイトカイン、遺伝子導入試薬などは、一部、研究室に既にあったものを使用することで対応できた。そのため、新たに購入した試薬が計画よりも少なくなった。また、Nras変異、Flt3変異白血病モデルマウスの作製を、当初の計画のレトロウイルスでの遺伝子発現・骨髄移植によるものから、ノックインマウスの使用に変更した。これらマウスの入手にかかる費用については別の財源で支出した。以上が、2021年度に翌年度への繰越分が生じた理由である。 2022年度は、構築した白血病モデルマウスの詳細な病態解析、マウスから単離した造血幹・前駆細胞のRNA-seq解析に費用を要するため、2021年度繰越額を合わせて使用予定である。