2021 Fiscal Year Research-status Report
CXCL12-CXCR4軸による造血幹細胞制御に必須の細胞内分子の網羅的探索
Project/Area Number |
21K08393
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Research Institution | Kyoto University |
Principal Investigator |
青木 一成 京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 助教 (30618020)
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Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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Keywords | CXCL12 / CXCR4 / CRISPR |
Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、CXCL12-CXCR4軸による造血幹細胞制御に必須の細胞内分子を網羅的に探索する。造血幹細胞は、ニッシェと呼ばれる骨髄の特別な微小環境によって維持されている。造血幹細胞ニッシェの主要な構成要素のひとつは、CXCL12、KITL、FOXC1、EBF3を特異的に高発現する特別な間葉系幹細胞で、CXCL12-abundant reticular (CAR) 細胞と呼ばれる (Morrison and Scadden, Nature 2014; Aoki et al., Br J Haematol 2021)。CXCL12-CXCR4軸は造血幹細胞の骨髄へのホーミング・骨髄での維持に必須であるが、造血幹細胞においてCXCL12に対する応答性を制御している遺伝子は完全には明らかにされていない。CXCL12-CXCR4軸による造血幹細胞制御に必須の細胞内分子を網羅的に探索するために、ゲノムワイドCRISPRスクリーニング法 (Koike-Yusa et al., Nat Biotechnol 2014; Tzelepis et al., Cell reports 2016) をin vitroでのケモタキシスアッセイに応用した独自にスクリーニング系を考案した。Cas9-GFPを安定的に発現させた白血病細胞株に、CXCR4に対するgRNAを導入したところ、細胞表面のCXCR4タンパク発現量は著減し、CXCL12に対するケモタキシス活性は20%以下に低下することを確認した。このCas9-GFP発現白血病細胞株を用いて、ゲノムワイドCRISPRスクリーニング法とCXCL12に対するケモタキシスアッセイを組み合わせた新規スクリーニング系を構築した。本スクリーニングにより、CXCL12に対するケモタキシスに必須の遺伝子として、既知のCXCR4やRHOAなどに加えて、複数の新規遺伝子を同定することができた。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本研究計画では、初年度に、ゲノムワイドCRISPRスクリーニング法とCXCL12に対するケモタキシスアッセイを組み合わせた新規スクリーニング系を構築し、本スクリーニングによりCXCL12に対するケモタキシスに必須の遺伝子を網羅的に明らかにすることを計画していた。当初の予定通りに、ゲノムワイドCRISPRスクリーニング法とCXCL12に対するケモタキシスアッセイを組み合わせた新規スクリーニング系の構築に成功した。本スクリーニングにより、CXCL12に対するケモタキシスに必須の遺伝子として既知のCXCR4やRHOAなどしか抽出されてこない可能性は考えられたが、幸いなことに新規遺伝子を複数同定することができ、本研究計画は当初の計画以上に進展していると言える。
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Strategy for Future Research Activity |
CRISPR-Cas9システムを用いた遺伝学的手法により、今回同定した新規遺伝子が、スクリーニングで使用した細胞株以外の細胞株においてもCXCL12に対するケモタキシス活性を制御しているかどうかを明らかにする。また、今回同定した新規遺伝子に対する阻害薬による薬理学的手法を用いて、今回同定した新規遺伝子が、Patient-derived xenografts 細胞やヒト正常造血幹細胞、マウス造血幹細胞においてもCXCL12に対するケモタキシス活性を制御しているかどうかを明らかにする。さらに、今回同定した新規遺伝子がCXCL12に対するケモタキシス活性を制御する分子メカニズムを明らかにするため、CRISPR-Cas9システムを用いて当該遺伝子を遺伝学的に欠損させた細胞株のRNAシーケンスやChIPシーケンス、ATACシーケンスなどを実施する。
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