Investigating molecular basis of chemoresistance using a novel leukemia cell line harboring high-risk chromosome abnormalities

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K08400
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 國本 博義 横浜市立大学, 医学部, 助教 (80464923)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中島 秀明 横浜市立大学, 医学研究科, 教授 (30217723)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: YCU-AML1

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、inv(3)/t(3;3)のみ及びinv(3)/t(3;3)と-7を両方有する白血病細胞株・患者検体から細胞培養系と異種移植モデルを作製し、抗がん剤シタラビンが細胞生存、アポトーシス誘導に与える影響を明らかにすることを目指し研究を開始した。まずinv(3)/t(3;3)単独株(MUTZ-3、Kasumi-3、HNT-34)、inv(3)/t(3;3)と-7を有する細胞株(YCU-AML1、OCI-AML20)をメチルセルロース培地上でシタラビン存在下に培養したところ、HNT-34並びにYCU-AML1はうまくコロニー形成がみられた一方、MUTZ-3、Kasumi-3、OCI-AML20についてはコロニーがうまく形成されず、コロニー培養実験では抗がん剤感受性を正確に評価することが困難であった。そこでMUTZ-3、Kasumi-3、OCI-AML20については液体培養液を用いてシタラビン存在下に培養したところ、OCI-AML20とMUTZ-3についてはシタラビンに高い感受性を認めたのに対してKasumi-3はシタラビン耐性を示した。以上からinv(3)/t(3;3)のみを有する細胞に比べてinv(3)/t(3;3)と-7を有する白血病細胞の方が抗がん剤シタラビンへの耐性を示すという仮説は成立しないことが判明した。そこでinv(3)/t(3;3)と-7を有する白血病細胞特異的に薬剤感受性を示す化合物を網羅的に探索するためにTocriscreen 2.0を用いて解析したところ、エピゲノム因子Xに対する阻害剤がinv(3)/t(3;3)と-7を有するYCU-AML1とOCI-AML20に特異的に高い感受性を示すことが確認された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究ではinv(3)/t(3;3)と-7を両方有する白血病細胞はinv(3)/t(3;3)のみを有する細胞に比べシタラビンに対してより強力な薬剤耐性を有するのではないかという仮説を立てた。本仮説を検証するため、まずinv(3)/t(3;3)単独株(MUTZ-3、Kasumi-3、HNT-34)、inv(3)/t(3;3)と-7を有する細胞株(YCU-AML1、OCI-AML20)をメチルセルロース培地上でシタラビン存在下に培養したところ、HNT-34並びにYCU-AML1はコロニー形成がみられた一方、MUTZ-3、Kasumi-3、OCI-AML20についてはコロニーがうまく形成されず、コロニー培養実験では抗がん剤感受性を正確に評価することが困難であった。そこでMUTZ-3、Kasumi-3、OCI-AML20については液体培養液を用いてシタラビン存在下に培養したところ、OCI-AML20とMUTZ-3についてはシタラビンに高い感受性を認めたのに対しKasumi-3はシタラビン耐性を示した。以上からinv(3)/t(3;3)のみを有する細胞に比べてinv(3)/t(3;3)と-7を有する白血病細胞の方がシタラビンへの耐性を示すという仮説は成立しないことが判明し、当初の研究計画からの修正を余儀なくされた。そこでinv(3)/t(3;3)と-7を有する白血病細胞特異的に薬剤感受性を示す化合物を網羅的に探索するためにTocriscreen 2.0を用いて解析したところ、エピゲノム因子Xに対する阻害剤がinv(3)/t(3;3)と-7を有するYCU-AML1とOCI-AML20に特異的に高い感受性を示すことが確認された。以上より、inv(3)/t(3;3)と-7を有する白血病細胞の生存はエピゲノム因子Xに高度に依存していると考えられ、新たな研究仮説を検証するべく研究を進めていく。

Strategy for Future Research Activity

本研究ではinv(3)/t(3;3)と-7の両者を有する白血病細胞の生存、増殖、細胞周期、アポトーシス誘導効率に対するエピゲノム因子X阻害の影響をin vitro、in vivo双方の実験系で明らかにするため、以下の実験を行う。
実験①：inv(3)/t(3;3)単独株(MUTZ-3、Kasumi-3、HNT-34)、inv(3)/t(3;3)と-7を有する細胞株(YCU-AML1、OCI-AML20)及びそれぞれの染色体異常を有する患者骨髄検体を液体培養液中でエピゲノム因子X阻害剤存在下に培養し、MUTZ-3、Kasumi-3、HNT-34に比べYCU-AML1、OCI-AML20において増殖能が阻害されるのかを明らかにする。
実験②：inv(3)/t(3;3)と-7を有する白血病細胞でエピゲノム因子Xの阻害により細胞周期進展の抑制並びにアポトーシス誘導がより効率的に観察されるのかを検討するため、実験①で培養した細胞を回収し、Ki67/DAPI染色並びにAnnexin V/DAPI染色を行う。inv(3)/t(3;3)単独細胞株に比べinv(3)/t(3;3)と-7を有する細胞株で増殖期分画(Ki67+/DAPI+)の割合が低く、アポトーシス誘導分画(Annexin V+/DAPI-)の割合が高いのかを明らかにする。
実験③：inv(3)/t(3;3)単独群及びinv(3)/t(3;3)と-7を有する細胞群の異種移植モデルにエピゲノム因子X阻害剤を投与し、治療後に残存した末梢血・骨髄・脾臓CD33陽性細胞の割合が低く、また増殖期分画(Ki67+/DAPI+)の割合が低くアポトーシス誘導分画(Annexin V+/DAPI-)の割合が高いのかを確認する。

Causes of Carryover

本研究では、inv(3)/t(3;3)のみを有する細胞に比べてinv(3)/t(3;3)と-7を有する白血病細胞の方が抗がん剤シタラビンへの耐性を示すという仮説は成立しないことが判明し、当初の研究計画からの修正を余儀なくされた。このため、申請時に想定していた使用計画通りに支出が進まず、次年度使用額が生じる要因となった。今後の研究推進方策の欄に記載の通りの研究計画を遂行するために、以下のような新たな使用計画を策定した。
実験動物費用（600千円、マウス飼育費、骨髄移植レシピエント用マウス購入費）
試薬備品購入費（1000千円、細胞周期解析試薬、アポトーシス解析試薬、フローサイトメトリー用抗体試薬、培養液及びリン酸緩衝生理食塩液、エピゲノム因子X阻害剤、ピペッター、チップ、細胞培養用ディッシュ・プレート）