2021 Fiscal Year Research-status Report
骨と骨髄の発生における未分化間葉系細胞の分化運命決定機序の解析
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21K08417
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
住谷 瑛理子 九州大学, 生体防御医学研究所, 助教 (50724754)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 骨髄ストローマ細胞 / RANKL / 発生 / 細胞分化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
哺乳類の主要な造血の場である骨髄を構成する骨髄ストローマ細胞は、造血幹細胞の維持に働く細胞集団であることが知られているが、個々の骨髄ストローマ細胞の機能的な違いや骨髄中における分布、発生学的な出自は解明されていない。本研究は胎児期に始まる骨髄の形成過程において出現する最初期の骨髄ストローマ細胞の起源と分化系譜を解析することで骨髄造血の開始に骨髄ストローマ細胞が果たす役割の解明を目指す。これまでの研究において胎齢15日のマウス胎仔軟骨膜に局在するRANKL発現細胞（E15-RANKL陽性細胞）を見出し、この細胞が新生仔期の骨髄造血に重要であることおよび発生の進行に伴いLepR陽性骨髄ストローマ細胞を含む複数の間葉系細胞種に分化する未分化な細胞であることを明らかにした。そこで今回E15-RANKL陽性細胞およびE15-RANKL陽性細胞を新生仔期まで追跡した細胞群に対してそれぞれ一細胞遺伝子発現解析を行い、各タイムポイントのデータを統合して解析することでE15-RANKL陽性細胞が発生の進行に伴ってどのような細胞集団へ変化するかを調べた。その結果、未分化細胞集団を起点として骨芽細胞および二種類の骨髄ストローマ細胞集団へ枝分かれする分化経路の存在を示唆する結果が得られた。また、この検討により骨原基中の様々な細胞集団の遺伝子発現プロファイルが明らかになったことで、骨髄ストローマ細胞の分化機序の解明に向けて足掛かりが得られた。本研究において骨髄ストローマ細胞の前駆細胞を同定し、その下流の分化系譜を明らかにすることができれば、培養細胞を用いた骨髄ストローマ細胞の分化系の開発に向けた基盤的知見が得られ、たとえば化学療法などにより低下した骨髄機能の回復を促進する治療法の開発に役立つことが期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでの研究においてRANKL発現細胞を時期特異的に蛍光タンパク質tdTomatoで標識することができるマウスの解析を行い、胎齢15日(E15)の骨原基にRANKL発現細胞（E15-RANKL陽性細胞）が出現することおよびE15-RANKL陽性細胞が出生時までに骨髄ストローマ細胞や骨芽細胞など複数の間葉系細胞種に分化することを明らかにしてきた。そこで本研究ではまずE15-RANKL陽性細胞の一細胞遺伝子発現解析（scRNA-seq）を行い、E15-RANKL陽性細胞の性状を調べた。その結果、E15-RANKL陽性細胞は３つの亜集団（軟骨膜細胞、骨芽細胞および未分化な遺伝子発現プロファイルを持つ細胞集団）にクラスタリングされることがわかった。次にE15-RANKL陽性細胞が骨髄ストローマ細胞に分化するまでの遺伝子発現の変遷を明らかにするために、時期特異的に標識したE15-RANKL陽性細胞を胎齢17日(E17)および出生後3日(P3)の各タイムポイントにおいて幼若骨より単離し、scRNA-seq解析を行った。E15、E17およびP3の結果を統合してクラスタリングを行い、UMAPプロットを作成したところ、E15-RANKL陽性細胞が発生ステージの進行に伴って、より分化した細胞の特徴を示すクラスターに分布するようになることがわかった。また、このE15~P3統合データのクラスタリング結果を用いてtrajectory解析を行ったところ、E15の未分化細胞集団を起点として骨芽細胞および二種類の骨髄ストローマ細胞へ枝分かれした分化経路推定図が得られた。さらにこのTrajectory解析によって、枝分かれ図の根元にプロットされた未分化細胞集団において高発現する遺伝子がいくつか同定された。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在までのscRNA-seq解析の結果から、E15-RANKL陽性細胞が複数のクラスターに分類可能なヘテロな細胞集団であることがわかった。各クラスターの発現遺伝子リストが得られたことから、今後はE15-RANKL陽性細胞のうちどのような遺伝子発現プロファイルを持つ亜集団が骨髄ストローマ細胞の前駆細胞であるかを検証したい。具体的な方策としては、E15-RANKL陽性細胞に対するtrajectory解析により同定された未分化細胞集団に高発現する遺伝子Xが骨髄ストローマ細胞前駆細胞のマーカー遺伝子となり得るか否かを検討する。まず遺伝子Xを発現する細胞を蛍光タンパク質で標識できるレポーターマウスやフェイトマップマウスを作成し、骨髄ストローマ細胞がレポータータンパク質でラベルされるか否かを調べる。次にE15骨原基からX発現細胞をセルソーティングにより単離し、RNA-seqによりX発現細胞が高発現する遺伝子群を明らかにする。またX発現細胞に対するATAC-seq解析を行い、X発現細胞に特有のオープンクロマチン領域を調べることで骨髄ストローマ細胞への分化能に関連する可能性のあるDNA領域や当該領域に含まれる転写因子結合配列を明らかにする。特にRNA-seqで高発現が示された遺伝子や既知の骨髄ストローマ細胞関連遺伝子の周辺領域を中心に解析することで、骨髄ストローマ細胞への分化制御のメカニズムを探る。さらにE15骨原基から単離したX発現細胞の培養を試みる。X発現細胞がLepR、CXCL12、SCFなどの骨髄ストローマ細胞のマーカー分子を高発現する細胞に分化する培養条件を検討する。
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