レチノイン酸によるマクロファージ・パイロトーシス制御機構

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K08433
• Research Institution: Hirosaki University
• Principal Investigator: 平賀 寛人 弘前大学, 医学部附属病院, 講師 (80637546)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: レチノイン酸 / ビタミンA / マクロファージ / パイロトーシス

Outline of Annual Research Achievements

VADマウスでは腸炎モデル・感染モデルのいずれにおいても宿主抵抗性が減弱しており、ビタミンAがマクロファージのパイロトーシスに及ぼす影響と炎症性腸疾患の病因・病態に関与している可能性に着目し、本研究を進めている。当該年度に実施した研究の成果は下記の通りである。

①自己炎症性疾患患者における血清中ビタミンA・血清中及び腸管局所のIL-1b発現の測定
当科外来・入院で加療中の患者（活動期CD、寛解期CD、BD、FMF）から採血を施行し、血清中ビタミンA濃度・IL-1bをBML社に外注・委託して測定する。同時期の内視鏡下生検サンプル（終末回腸・盲腸、病変部と正常部）からmRNAを抽出、real-time PCRでIL-1b・Caspase-11・Gsdmd・NLRP3・Caspase-1発現量を定量する。
②自己炎症性疾患患者PBMCの採取、LPS刺激時パイロトーシス評価（LDH-releasing assay）
③VADマウスの作製：妊娠雌をビタミンA欠乏食（オリエンタルイースト社）で飼育、10週齢まで欠乏食を継続。対照群として通常餌で飼育したVitamin A-sufficient (VAS)マウスを用いる。DSS腸炎誘発：VAS・VADマウスに4% DSS（M.W. 5000, WAKO）自由飲水で腸炎を誘発。0・1・2日後にコラゲナーゼ法でLPMCを分離、LPS添加して培養、パイロトーシスを評価。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

自己炎症性疾患患者の血清・内視鏡サンプリングが当初の予定よりは進展が遅れているが、その他計画通りである。

Strategy for Future Research Activity

本年度の計画は下記の通りである。
①CD11b+脾細胞分離・培養：VAS・VADマウスから脾臓を摘出、コラゲナーゼ処理・破砕・溶血をへて脾細胞を分離する。CD11b+脾細胞をマグネットビーズで標識し、AUTOMACS（Miltenyi Biotec社）で分離する。10% FBS RPMIで5X106 /mlに細胞浮遊液を調整し、対照群・LPS添加群（10 μg/ml）に分けて培養する。
②マクロファージ細胞株のRARをsiRNA処理：マクロファージ細胞株であるRAW264.7（マウス）・THP-1（ヒト）のRARをHiPerFect Transfection Reagent/QUIAGEN社を用いてsiRNA処理し、対照群・LPS添加群（10 μg/ml）に分けて培養する。
③ ①②を用いてパイロトーシスを解析（上清中IL-1b測定, LDH-releasing assay等）。

Causes of Carryover

自己炎症性疾患患者の血清・内視鏡サンプリングが遅れており、次年度にサンプル収集を進めてmRNAを抽出、real-time PCRでIL-1b・Caspase-11・Gsdmd・NLRP3・Caspase-1発現量を定量する予定である。