脂肪幹細胞を用いた唾液腺機能の回復-ドライマウスに対する細胞治療法の開発

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K08449
• Research Institution: Kanazawa Medical University
• Principal Investigator: 河南 崇典 金沢医科大学, 医学部, 講師 (20350762)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 石垣 靖人 金沢医科大学, 総合医学研究所, 教授 (20232275) ; 正木 康史 金沢医科大学, 医学部, 教授 (40238895)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 脂肪幹細胞 / ドライマウス / 再生医療

Outline of Annual Research Achievements

C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)グリーンマウスから得られた脂肪由来幹細胞(ASC)を、シェーグレン症候群(SS)の病態を示すモデルマウスに移入を行った。SSモデルマウスとしては、NZB/Nslc x NZW/NSlc F1の交配によって生まれるNZBWF1マウスを使用した。当該マウスは、顎下腺における炎症性細胞浸潤が観察される。ASCの移植治療効果を検討する前段階として、 NZBWF1マウスの炎症性細胞浸潤について検討を行った。NZBWF1マウス(4ヶ月齢)を購入し、当大学にて1ヶ月以上飼育したマウスの内、炎症性細胞浸潤の確認ができた割合は80%であった。
また、ASCの供与体としてC57BL/6-Tg(CAG-EGFP)マウス(6週齢)の鼠径部脂肪組織を切除・細切した後にコラゲナーゼにより分散、プレート上に播種し、脂肪幹細胞の採取を行った。得られた脂肪幹細胞を既知の各種細胞表面マーカーの発現について確認を行うと共に、骨、軟骨および脂肪への分化の確認を行った。
NZBWF1マウスは、5ヶ月齢以降の♀マウスでSSの病態を高率に発症する。5ヶ月齢になった♀マウスを用い、ASCの移入を行った。 ASCとアテロコラーゲンゲルの混合液を作成し、1x105 cellsのASCを顎下腺近傍に移入した。ASC投与群, ASC非投与群, Wild type群(C57BL/6)の1,3,5週目の血清をアニマルランセットで採血し、5週目にそれぞれの顎下腺、涙腺を採取し、HEとPAS/Alucian Blue(pH2.5)染色を行い、「腺房」と「導管」の粘液分泌の機能の更新、減弱、唾液分泌の機能破壊(組織の萎縮などによる崩壊)の観察を行った。また投与5週目に採取した顎下腺・涙腺のGFP陽性細胞の生着と分化について検討を行った。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

NZBWF1マウスは、SSの病態を自然発症するが、発症の割合、頻度にばらつきがある。本実験では、SSの病態を示すモデルマウスへの、ASCによる治療効果、生着と分化を評価する必要があるため、モデルマウスにおけるSSの発症の割合、頻度、病態の定量的・定性的評価(炎症性細胞浸潤のfocus score)が必須となる。これらの評価法について検討を行っている。
グリーンマウスから得られたASCについては、既知の脂肪幹細胞のマーカーであるCD29, CD44, CD73, CD90, CD105, CD117, anti-Sca1で評価を行い、また、その分化能についても確認を行っている。

Strategy for Future Research Activity

NZBWF1マウスの、SSの病態による唾液腺傷害とその評価について経時的な炎症性細胞浸潤のfocus scoreの測定と、形態学的な組織障害および唾液分泌量の測定を行い、SS病態モデルの定性的・定量的評価法を確立する。また、ASCの移入による組織の再生、生着と分化、治療効果を測定するため、両側顎下腺へのASCの投与群、非投与群を比較し、唾液分泌能の再生、改善、形態学的な評価、総タンパク量の測定、確認を行う。また、ASCの投与について、単回投与試験、反復投与試験も実施する。

Causes of Carryover

NZBWF1マウスは、自然発症によりSSの病態を示す。自然発症モデルであるため、病態形成までに時間を有し、その評価について検討を費やす必要があった。2021年度内に予定していた解析を2022年度内に実施するため、それに係る費用の繰越金が発生している。

Research Products

• [Journal Article] Comprehensive analysis of protein-expression changes specific to immunoglobulin G4-related disease (2021)
  • Author(s): Takafumi Kawanami, Haruka Kawanami-Iwao, Takanobu Takata, Yasuhito Ishigaki, Naohisa Tomosugi, Tsutomu Takegami, Hiroto Yanagisawa, Shino Fujimoto, Tomoyuki Sakai, Yoshimasa Fujita, Kazunori Yamada, Shuichi Mizuta, Hiroshi Kawabata, Toshihiro Fukushima, Yuko Hirose, Yasufumi Masaki
  • Journal Title: Clin Chim Acta. Volume: 523 Pages: 45-57.
  • DOI: 10.1016/j.cca.2021.08.025
  • Peer Reviewed / Open Access