2022 Fiscal Year Research-status Report
Significance of genomic diversity of NOX2 complex in onset and pathogenesis of systemic lupus erythematosus
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21K08470
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
川崎 綾 筑波大学, 医学医療系, 助教 (30532816)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
河野 肇 帝京大学, 医学部, 教授 (60585074)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 全身性エリテマトーデス / NCF1 / 疾患感受性遺伝子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
全身性エリテマトーデス(SLE)の疾患感受性遺伝子であるNCF1遺伝子には相同性が非常に高い偽遺伝子(NCF1B、NCF1C)が存在するため、NCF1遺伝子領域の解析は非常に困難となっている。SLE感受性バリアントとしてNCF1 Arg90Hisが同定されているが、NCF1遺伝子とSLEの関連はまだ十分解析されておらず、新たな疾患感受性バリアントが存在する可能性が考えられる。本研究では、①正確なNCF1遺伝子配列の決定を目的としたロングリードシークエンス解析、②SLE感受性NCF1バリアントの同定を目的としたショートリードシークエンス解析を行っている。①ではNCF1と偽遺伝子を共通のプライマーで増幅後にPacBio社Sequelシステムにてロングリードシークエンス解析を行った。遺伝子間の相同性が99%以上と非常に高いため、各遺伝子のリードを区別することが難しく現在も条件検討を継続している。②においてはNCF1特異的サイトにプライマーを設定し、NCF1遺伝子全長を２つのフラグメントに分けて増幅した。その後イルミナ社MiSeqにてシークエンス解析を実施した。得られたリードをヒトゲノムリファレンス配列 hg38にマッピングしバリアントの検出を行った。24検体の解析において100箇所以上のNCF1バリアントが検出された。予備検討においてMiSeq を用いたNCF1遺伝子解析が可能であることが確認できたので、次年度はSLEおよび健常者のサンプルを用いてシークエンス解析を実施し、SLE疾患感受性バリアントの同定を試みる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
MiSeq解析において、PCRにてNCF1遺伝子を増幅後に、酵素処理による断片化、ライブラリー調整を行ったが、ライブラリーサイズを目的とするフラグメント長に揃えることが難しく、断片化条件の検討、ライブラリー調整試薬の選択に時間を要した。そのため多数サンプルの解析、その後の関連解析まで至らなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続きロングリードシークエンス解析にて、NCF1および偽遺伝子の配列決定とNCF1特異的部位の特定を試みる。さらにロングリード、ショートリードシークエンス解析により得られたバリアントデータを比較することにより、シークエンスデータの妥当性を評価する。ショートリードシークエンス解析においては、SLE 192例、健常対照者192例の解析を行い、検出されたNCF1バリアントについて関連解析を実施する。有意な関連が認められたバリアントについては、サンプル数を増やしてreplication studyを実施し関連の確認を行う。
NCF1とともにNOX2複合体を形成するNCF2, NCF4遺伝子のバリアントを対象に関連研究を実施し、NOX2複合体構成遺伝子とSLEの関連を包括的に解析する。
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| Causes of Carryover |
ショートリードシークエンス解析において、ライブラリー調整の条件検討に時間を要したため、少数検体の解析までしか行えなかった。そのため多数検体解析用のライブラリー調整試薬、シークエンス試薬の購入に至らず次年度使用が生じた。
2022年度に使用予定であった研究費は当初の予定通り、ショートリードシークエンス解析に用いる試薬、消耗品の購入費に充てる。
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[Journal Article] Genetic dissection of HLA-DRB1*15:01 and XL9 region variants in Japanese patients with systemic lupus erythematosus: Primary role for HLA-DRB1*15:012023
Author(s)
Aya Kawasaki, Premita Ari Kusumawati, Yuka Kawamura, Yuya Kondo, Makio Kusaoi, Hirofumi Amano, Yasuyoshi Kusanagi, Kenji Itoh, Takashi Fujimoto, Naoto Tamura, Hiroshi Hashimoto, Isao Matsumoto, Takayuki Sumida, Naoyuki Tsuchiya
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Journal Title
medRxiv
Volume: －
Pages: －
DOI
Open Access
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[Presentation] 全身性エリテマトーデスにおけるXL9領域バリアントの関連解析およびHLA-DRB1との独立性の検討2022
Author(s)
川崎綾, 近藤裕也, 藤本隆, 草生真規雄, 天野浩文, 田村直人, 草薙恭圭, 伊藤健司, 松本功, 住田孝之, 土屋尚之
Organizer
日本人類遺伝学会第67回大会
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