2021 Fiscal Year Research-status Report

Characterization of HTLV-1 specific CTLs detected in HAM patients

Research Project

Project/Area Number	21K08494
Research Institution	Kumamoto University
Principal Investigator	菅田謙治熊本大学, ヒトレトロウイルス学共同研究センター, 特定事業研究員 (10650616)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	HTLV1 / HAM / 抗原特異的T細胞
Outline of Annual Research Achievements	ヒトT細胞白血病ウイルス1型（HTLV-1）はCD4T細胞に感染することで難治性の腫瘍性疾患と炎症性疾患を感染者に惹起する。主に後者はHTLV-1関連脊髄症(HAM: HTLV-1-associated myelopathy)がよく知られており、難治性の慢性神経疾患である。多くのHTLV-1キャリアは無症状で経過するものの感染者の一部で発症することから、その発症には宿主免疫が強く関与している可能性が示唆されている。HAM患者ではHTLV-1抗原に対する強いT細胞応答が観察される。また、病巣である脊髄ではHTLV-1感染CD4T細胞とHTLV-1特異的細胞傷害性T細胞（CTL）の浸潤とそれに伴う炎症像が確認される。近年ではHAMに対する新規治療法としてHTLV-1感染細胞で発現が上昇しているCCR4（C-C chemokine receptor type 4）に対するヒト化モノクローナル抗体（モガムリズマブ）を投与することで生体内の感染細胞を排除する試みがなされている。HAMが難治性の疾患であることから、末梢血を用いた病態解析に基づいた発症予測マーカーの発見が重要な意味を持つことは明らかであるものの、これまで有用なHAM特異的マーカーは未だに見つかっていない。HAM患者の末梢血と脊髄では病態が異なり、末梢血での感染CD4T細胞やCTLの機能解析は必ずしも病巣のT細胞の病態を反映していない可能性が考えられた。本研究ではHAM患者の脊髄病変に浸潤しているHTLV-1抗原特異的CTLの遺伝子発現プロファイルに基づき、末梢血での同CTLが発現するHAMの発症リスク遺伝子を発見することを目的としている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 末梢組織でのHTLV-1の病態を解析するためにHAM患者（n=8）の脳脊髄液（CSF）を回収し、シングルセル解析によってT細胞受容体（TCR）配列のクロノタイプ解析を行なった。CD4T細胞では様々なTCRレパトアが観察された一方で、全てのHAM患者でCD8T細胞のオリゴクローナルな増加が観察された。それらCD8T細胞でdominantクローンが認識する抗原を調べるためにprediction解析を行なったところHLA-A24:02拘束性のHTLV-1抗原（Tax301-309）を認識することがわかった。それらの結果はHLA-A24:02陽性HAM患者5人中４人で観察された。その４人のHAM患者の末梢血中のCD8T細胞に対してHLAマルチマー染色を行なったところ、HLA-A24:02/Tax301-309マルチマー陽性細胞が検出された。一方、CD8T細胞でdominantクローンがHLA-A24/Tax301-309を認識しなかったHAM患者では末梢血中でもHLA-A24:02/Tax301-309マルチマー陽性細胞を検出することはできなかった。
Strategy for Future Research Activity	本年度は主にHAM患者由来CSFを用いてTCRのクロノタイプ解析を行なった。その結果、CSF中CD8T細胞のdominantクローンはHTLV-1抗原としてHLA-A24:02拘束性Tax301-309を認識していることが明らかとなった。次年度はCSFでの解析に加えて、比較対象としてHAM患者とHTLV-1キャリアの末梢血に対してマルチマー染色を行い、HLA-A24:02/Tax301-309特異的CD8T細胞を分取する。それらCD8T細胞からmRNAを回収し、遺伝子発現の比較を行うことでHAMマーカーの候補遺伝子群を選択する。同様にこれまでに論文で報告している成人T細胞白血病患者由来のCD8T細胞のデータを解析に加えることで、さらに詳細にHAM患者内でのCD8T細胞の病態を明らかにしていく。その得られた結果に基づいてフローサイトメトリーによってタンパクでの発現をHLA-A*24:02の有無に関係なく健常者・キャリア・HAM患者のCD8T細胞で測定を行い、HAMマーカーになりうるか検討を行う。加えて、HAM患者とHTLV-1キャリアから様々なHLA-A24/Tax301-309特異的TCR情報を得られることから、それらTCRのTaxペプチドに対するアフィニティの比較も行っていく予定である。