Elucidation of the genome replication mechanism of Toga and Matona viruses by host-virus interactome analysis

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K08500
• Research Institution: National Institute of Infectious Diseases
• Principal Investigator: 坂田 真史 国立感染症研究所, ウイルス第三部, 主任研究官 (20600547)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 風疹ウイルス / ゲノム複製 / 宿主因子 / インタラクトーム

Outline of Annual Research Achievements

風疹ウイルスのゲノム複製を担う非構造タンパク質へ近接ビオチン付加酵素を融合させたサブゲノムレプリコンRNA発現プラスミドベクターを構築した。そのベクターを風疹ウイルス感受性細胞へ導入し、ビオチンを添加することで非構造タンパク質の発現特異的にビオチン標識されたタンパク質を検出した。サブゲノムレプリコンRNA発現ベクターを導入した細胞を試料として質量分析を行って、既知の相互作用因子を含む162のビオチン標識タンパク質を同定した。同定タンパク質の遺伝子オントロジーエンリッチメント解析の結果、細胞接着因子群とmRNA代謝経路系に分類されるものが多く存在することが明らかになった。現在、これら同定タンパク質のゲノム複製への影響を各遺伝子のノックダウンにより評価中である。サブゲノムレプリコンRNAはゲノム複製に必要なウイルスゲノム領域と非構造タンパク質のみをコードしており、導入した細胞ではウイルス感染過程のゲノム複製のみが生じる。このベクターの構築と質量分析解析によりゲノム複製中の非構造タンパク質に近接する細胞因子の網羅的な同定方法を確立した。細胞接着因子群とmRNA代謝経路系の複数の因子が非構造タンパク質と近接して、ゲノム複製に寄与する可能性が示唆された。これまでに風疹ウイルスのゲノム複製に関わる細胞因子の網羅的な解析は報告されておらず、非構造タンパク質と相互作用する細胞因子も殆ど報告されてない。本研究により新規の相互作用候補因子が同定出来たと考えられる。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

研究計画では、近接ビオチン標識酵素遺伝子を導入した組換えウイルスを作製して、ビオチン標識タンパク質の同定を行う予定だった。ウイルス感染では質量分析に必要な量のビオチン標識タンパク質が得られなかった。そのため、サブゲノムレプリコンRNA発現プラスミドベクターを新たに構築し、質量分析の再解析を行った。

Strategy for Future Research Activity

候補因子のゲノム複製への影響を遺伝子ノックダウンとノックアウトにより評価する。影響があった因子については、非構造タンパク質との相互作用機序やゲノム複製のどの段階にどのような機構で関与するかを解析する。

Causes of Carryover

当初予定していた解析が実施出来なかったため、次年度使用額が生じた。解析方法を確立したため、次年度に解析を実施する。