2022 Fiscal Year Research-status Report
リアルタイム真菌種同定方法の開発とクリニカルメタゲノミクスへの応用
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21K08505
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
元岡 大祐 大阪大学, 微生物病研究所, 助教 (10636830)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | メタゲノム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、感染症が疑われる臨床検体からの病原体検出法として、次世代シーケンサーを用いたメタゲノム解析が用いられている。しかし、臨床検体中に含まれる核酸のうち病原体由来のものは少なく、感度向上、低コスト化や解析の高速化が達成できていない。また、メタゲノム解析における病原体同定は、ゲノムデータベースに依存した解析手法であるため、ゲノムデータベースに情報が少ない真菌の正確な同定が難しい。真菌感染症は、皮膚のみならず、免疫低下時の呼吸器感染症などで重篤な疾患を引き起こす。真菌感染の検査は、菌体数はβ-D-グルカンの定量によって推定され、その真菌種の同定は、単離培養後の形態観察や、あらゆる真菌が共通してもつ配列(rRNA)の一部であるITS領域などのシーケンスによって行われている。しかし、これらの手法により同一種であると認識されている真菌の中に病原性が異なる真菌が存在することも知られており、より正確かつ簡便に真菌を同定できる方法が必要である。そこで本研究では、rRNAの全長をターゲットにすることでより高分解能な真菌の種同定方法を構築することを目的とした。具体的には、CRISPR/Cas9システムのゲノムの特定配列を切断する機能を用いて、真菌ゲノムのrRNA領域を切り出し、リアルタイムに長鎖のシーケンスが可能であるNanoporeシーケンサーと組み合わせることで、真菌ゲノム全体を解析することなく、選択的に種同定に必要な配列のみをシーケンスする方法を検討している。本年度は、公共データベースに登録されている真菌由来のゲノム配列を対象に、アセンブリを行い、真菌ゲノムデータベースの構築を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度は、公共データベースに登録されている全ゲノムシーケンスデータを使って真菌ゲノム配列のアセンブリを行った。多くのシーケンスデータはショートリードシーケンサーのデータであるため、rRNA領域のアセンブリは難しく、rRNA配列に適したアセンブラの開発を行った。開発したアセンブラを用いて培養した真菌由来のショートリードシーケンサーによって得られたゲノムシーケンスデータを元にアセンブリを行った。構築したrRNA配列を前年度に取得したロングリードシーケンサーでシーケンスしたrRNA配列を比較したところ、Rhodotorula mucilaginosa、Rhizopus microsporus、Acremonium alternatum、Penicillium citrinum、Lichtheimia corymbifera、Candida glabrataなどの様々な種において、概ねアセンブリできていることが確認できた。ついで、公共データベースに登録されている真菌のショットガンデータをダウンロードし、本アセンブラを用いてアセンブリを行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの取り組みにより単離培養された真菌から、種の同定に必要なrRNA領域の選択的シーケンスができることを確認してきた。一方で、シーケンスされた配列の生物種をアノテーションするためには、より多くの真菌の全ゲノムもしくはrRNAの配列に対するデータベースが必要である。しかしながら、今回取得したrRNA全長配列のアノテーションを実際に行ったところ、データベース側の情報が少なく、あったとしてもrRNAの一部である18S領域、25S領域、あるいはITS領域といった配列しか登録されていないものが多く見られた。データベースの拡充は、本研究で構築している真菌rRNA特異的シーケンスを行っていくことでも可能である。しかし、膨大な数の真菌種すべてのシーケンスすることは費用面でも作業時間としても困難である。これまでの取り組みにより公共データベースにアップロードされている多くの真菌ゲノムシーケンスデータを活用することで、大規模なrRNAデータベースが構築できる見通しがたった。次年度は、引き続き公共データベースのデータを元に真菌rRNAデータベースの拡張、構築を進めるとともに、単離培養された株からの種同定パイプラインの構築に取り組む。
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| Causes of Carryover |
コロナ禍の影響により研究計画が遅れたため。
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